蛋白質的結構和功能級臨床、麻醉、檢驗等專業(yè)(曾)下學期

本章教學重點蛋白質元素組成特點，氨基酸結構通式，氨基酸分類、三字英文縮寫符號；肽、肽鍵的概念；蛋白質一、二、三、四級結構的概念及其穩(wěn)定的主要化學鍵；二級結構主要形式及結構特點；蛋白質結構與功能的關系；變構效應的概念；蛋白質兩性電離，膠體性質，蛋白質變性概念和意義，紫外吸收和呈色反應；模體、結構域、分子伴侶的概念；鹽析、電泳和分子篩效應的原理。當前1頁，總共100頁。概述1.什么是蛋白質?蛋白質(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。當前2頁，總共100頁。2.蛋白質的生物學重要性2-1.蛋白質是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織、細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：占人體干重的45％；脾、肺及橫紋肌等高達80％。當前3頁，總共100頁。1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞2-2.蛋白質具有重要的生物學功能2-3.氧化供能當前4頁，總共100頁。第1節(jié)蛋白質的分子組成Section1theMolecularComponentofProtein當前5頁，總共100頁。蛋白質的元素組成蛋白質元素組成的特點各種蛋白質的含氮量很接近且恒定，平均為16％。

通過測定生物樣品中的含氮量，再根據(jù)以下公式推算蛋白質的大致含量：主要有C、H、O、N和S。有些蛋白質含有少量磷或鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘。100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%當前6頁，總共100頁。1.氨基酸氨基酸是組成蛋白質的基本單位。組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且多屬L-氨基酸（僅甘氨酸除外）。L-glyceraldehyde(anL-sugar)L-serine(anL-AA)當前7頁，總共100頁。氨基酸的結構通式H甘氨酸CH3丙氨酸氨基酸的通式R當前8頁，總共100頁。1-1氨基酸的分類1）非極性脂肪族氨基酸2）極性中性氨基酸3）芳香族氨基酸4）酸性氨基酸5）堿性氨基酸*20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:｝當前9頁，總共100頁。1-1-1非極性脂肪族氨基酸(側鏈含烴鏈)當前10頁，總共100頁。1-1-2極性中性氨基酸(側鏈有極性但不帶電荷)當前11頁，總共100頁。1-1-3芳香族氨基酸(側鏈含芳香基團)當前12頁，總共100頁。1-1-4酸性氨基酸(側鏈含負性解離基團)當前13頁，總共100頁。1-1-5堿性氨基酸(側鏈含正性解離基團)當前14頁，總共100頁。幾種特殊氨基酸脯氨酸（亞氨基酸）半胱氨酸(含巰基)

當前15頁，總共100頁。+胱氨酸二硫鍵-HH當前16頁，總共100頁。1-2氨基酸的理化性質1-2-1.兩性解離及等電點等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。當前17頁，總共100頁。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子當前18頁，總共100頁。怎樣確定氨基酸pI酸堿滴定根據(jù)酸堿基團pKa計算中性氨基酸pI酸性氨基酸pI堿性氨基酸pI當前19頁，總共100頁。1-2-2.紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收Trp、Tyr(含共軛雙鍵)最大吸收峰在280nm附近。大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。當前20頁，總共100頁。1-2-3茚三酮反應氨基酸與茚三酮水合物共熱，大多可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此峰值與氨基酸的含量存在正比關系，可作為氨基酸定量分析方法。(氧化脫羧脫氨)當前21頁，總共100頁。2.肽2-1肽(peptide)*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。當前22頁，總共100頁。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵當前23頁，總共100頁。*

兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*

由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。當前24頁，總共100頁。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。當前25頁，總共100頁。N末端C末端牛核糖核酸酶當前26頁，總共100頁。2-2幾種重要的生物活性肽2-2-1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)當前27頁，總共100頁。GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH與GSSG間的轉換當前28頁，總共100頁。

體內許多激素屬寡肽或多肽神經(jīng)肽(neuropeptide)2-2-2.多肽類激素及神經(jīng)肽當前29頁，總共100頁。第2節(jié)蛋白質的分子結構Section2theMolecularStructureofProtein當前30頁，總共100頁。蛋白質的分子結構包括

一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構當前31頁，總共100頁。1.蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構是指多肽鏈中氨基酸的排列順序。穩(wěn)定蛋白質一級結構的主要化學鍵是肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。蛋白質一級結構是空間結構和功能的基礎，但不是唯一的因素。當前32頁，總共100頁。當前33頁，總共100頁。2.蛋白質的二級結構蛋白質的二級結構是指多肽鏈中某個肽段的主鏈骨架原子的相對空間位置。主鏈骨架原子包括N(H)，C(O)和相鄰的2個C。穩(wěn)定蛋白質二級結構的主要化學鍵是氫鍵。當前34頁，總共100頁。2-1肽單元或肽單位(peptideunit)57°47°參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元。當前35頁，總共100頁。2-2二級結構的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉角(-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil)

當前36頁，總共100頁。2-2-1-螺旋肽段主鏈圍繞中心軸做有規(guī)律的螺旋式上升,螺旋走向為順時針(右手螺旋).肽單位(肽平面)圍繞N-Cα鍵旋轉57°(Phi角)或繞C-Cα鍵旋轉47°(Psi角).氨基酸側鏈伸向螺旋外側.每3.6個氨基酸殘基上升一圈(360°),螺距為0.54nm.每個肽鍵的N-H和第四個肽鍵的C=O形成與長軸平行的氫鍵.2Cα間距0.15nm。當前37頁，總共100頁。當前38頁，總共100頁。影響-螺旋形成的因素氨基酸結構剛性(Pro)氨基酸形成離子鍵或靜電斥力

(Glu/Asp/His/Lys/Arg)氨基酸側鏈大小(Val/Ile)當前39頁，總共100頁。2-2-2-折疊

伸展(2C間的距離達0.35nm)

瘦長/彎曲/桶狀，兩鏈同向或反向在不同鏈或同一條鏈不同片段形成氫鍵側鏈突出在折疊的上方或下方強度大,有剛性當前40頁，總共100頁。2-2-3-轉角和無規(guī)卷曲-轉角無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。

常由4個AA殘基組成

1stAA-C=O與4thAA-N-H形成氫鍵

2ndAA是Pro或Gly/Asp/Asn/Trp

形似發(fā)夾反向常見于反向平行末端當前41頁，總共100頁。2-3超二級結構(模體/模序，motif)二級結構組合形式如：

，β

β，ββ。在許多蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近所形成的有規(guī)則的二級結構組合，被稱為模體(motif)。模體是賦予功能含義的超二級結構。當前42頁，總共100頁。

當前43頁，總共100頁。鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構當前44頁，總共100頁。2-4側鏈對二級結構形成的影響蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。當前45頁，總共100頁。theconformationalpreferencesofthe20AAsforthe

-helixGlu、Met、Ala、LeuLys、Phe、Gln、Trp、Ile、ValAsp、HisCys、Ser、Thr、ArgAsn、TyrGly、ProStrongWeakWeak(usuallyfoundinthebeta-reverseturn)當前46頁，總共100頁。3.蛋白質的三級結構整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布。在二級結構基礎上進一步折疊形成天然結構/功能結構穩(wěn)定因素：疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。當前47頁，總共100頁。當前48頁，總共100頁。肌紅蛋白(Mb)三級結構N端

C端當前49頁，總共100頁。3-1結構域(domain)較大的蛋白質分子中折疊形成的

結構較為緊密的具獨特空間構象的并各行其功能的局部區(qū)域稱之纖連蛋白分子的結構域當前50頁，總共100頁。3-2分子伴侶(chaperon)*熱休克蛋白70(Hsp70)*伴侶蛋白(chaperonin)(如Hsp60/GroEL、GroES)*核質蛋白(nucleoplasmin)是為加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構提供合適微環(huán)境的一類蛋白質。當前51頁，總共100頁。*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。*分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。當前52頁，總共100頁。當前53頁，總共100頁。4.蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。含有二條或多條多肽鏈的蛋白質分子中，每條具有完整三級結構的多肽鏈稱為蛋白質的亞基(subunit)。亞基間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。由2個亞基組成的蛋白質四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結構不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。當前54頁，總共100頁。血紅蛋白的四級結構當前55頁，總共100頁。5.蛋白質組學蛋白質組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質，即“一種基因組所表達的全套蛋白質”。蛋白質組學是研究細胞或機體全部蛋白質的表達及其活動方式(包括翻譯后修飾、轉運定位、結構變化、蛋白質間相互作用等)，揭示蛋白質功能與生命活動規(guī)律的一個新的研究領域。當前56頁，總共100頁。蛋白質組學是高通量，高效率的研究，其研究技術平臺：雙向電泳分離樣品蛋白質蛋白質點的定位、切取蛋白質點的質譜分析蛋白質組學研究的科學意義闡明生命在生理或病理狀態(tài)下的變化規(guī)律疾病診斷、新藥篩選、農業(yè)、環(huán)保等當前57頁，總共100頁。第3節(jié)蛋白質結構與功能的關系Section3TheRelationofStructure&FunctionofProtein當前58頁，總共100頁。1.蛋白質一級結構與功能的關系1-1一級結構是空間結構的基礎牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵當前59頁，總共100頁。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性牛核糖核酸酶當前60頁，總共100頁。1-2一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構和功能胰島素氨基酸殘基序號A5A6A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla馬ThrSerIleAla當前61頁，總共100頁。1-3一級結構提供重要的生物進化信息細胞色素(cytochromeC)的進化樹當前62頁，總共100頁。表：細胞色素C的種屬差異量（以人CytC為參照）生物名稱黑猩猩恒河猴兔袋鼠鯨牛豬羊狗騾馬殘基差異數(shù)0191010

10

101112生物名稱雞、火雞響尾蛇烏龜狗、魚蛾小麥面包霉酵母殘基差異數(shù)1314153131354345同一種蛋白質一級結構差異愈小，物種間進化愈接近當前63頁，總共100頁。1-4一級結構改變可引起疾病例如：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。當前64頁，總共100頁。2.蛋白質空間結構與功能的關系2-1Hb亞基與Mb空間結構相似，都具有運輸氧氣的功能MbHbαHbβHbA當前65頁，總共100頁。2-2Hb亞基構象變化可影響亞基與氧結合Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。O2saturationpO2(mmHg)P50P50Hb和Mb的氧結合/解離曲線S型矩型當前66頁，總共100頁。變構效應(allostericeffect)又稱別構效應。是指寡聚體蛋白質與其配體結合后，引起該蛋白質分子的構象變化，而導致其活性改變的現(xiàn)象。當前67頁，總共100頁。*協(xié)同效應(cooperativity)寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中其他亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱之。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應

(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應

(negativecooperativity)當前68頁，總共100頁。Deoxy-HbOxy-Hb當前69頁，總共100頁。O2血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。當前70頁，總共100頁。2-3蛋白質構象改變與疾病

若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。這類疾病如：人紋狀體脊髓變性病、腦退行性疾病、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。當前71頁，總共100頁。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病當前72頁，總共100頁。第4節(jié)蛋白質的理化性質Section4ThePhysical&ChemicalCharactersofProtein當前73頁，總共100頁。1.蛋白質的兩性解離蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下可解離成帶負電荷或正電荷的基團。

當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

。當前74頁，總共100頁。2.蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至數(shù)百萬kD，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。

穩(wěn)定蛋白質膠體的因素：顆粒表面電荷、水化膜。當前75頁，總共100頁。+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉當前76頁，總共100頁。3.蛋白質的變性、凝固和沉淀蛋白質的變性(denaturation)是在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。

變性蛋白質的特征：（二硫鍵、非共價鍵破壞，溶解度降低，

黏度增加，不易結晶，易沉淀，易被蛋白酶水解，生物學活性喪失）當前77頁，總共100頁。造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。當前78頁，總共100頁。應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

當前79頁，總共100頁。若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)

。天然狀態(tài)，有催化活性非折疊狀態(tài)，無活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇當前80頁，總共100頁。*蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融合相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

當前81頁，總共100頁。4.蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。當前82頁，總共100頁。5.蛋白質的呈色反應⒈茚三酮反應(ninhydrinreaction)

蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。⒉雙縮脲反應(biuretreaction)

蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。當前83頁，總共100頁?！鳟斍?4頁，總共100頁。Peptidesandproteins(long-chainpolypeptides)reactwithCu2+inalkalinitytocreateablueviolet/redcolor.Thepeptidemusthaveatleast2peptidebonds.So,aminoacids…當前85頁，總共100頁。第5節(jié)蛋白質的分離純化與結構分析Section5Separation,Purification&AnalysisofProtein（自學）當前86頁，總共100頁。1.透析及超濾*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。當前87頁，總共100頁。2.丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。當前88頁，總共100頁。*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。當前89頁，總共100頁。3.電泳

蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳