miRa抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其機制研究

miRa抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其機制研究第1頁/共19頁miR-26a：微小

RNA

（microRNA

）是一類長約

22nt

的核苷酸單鏈小分子

RNA

，分布于各種生物中，對基因的表達起著重要的調(diào)控作用。目前miR-26a在腫瘤中研究如火如荼，尤其以肝癌中的研究最多。miR-26a在肝癌中低表達，機體炎癥反應(yīng)增強，肝癌加重。然而關(guān)于miR-26a在結(jié)腸癌中的表達情況、生物學(xué)功能以及參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制文獻報道較少。關(guān)鍵詞第2頁/共19頁炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌：由結(jié)腸或直腸炎癥引起的結(jié)腸或直腸癌炎癥微環(huán)境可以影響腫瘤的發(fā)生和腫瘤形成，從臨床前研究和臨床研究通過潛在分子機制已經(jīng)證明炎癥持續(xù)發(fā)生會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是發(fā)生癌變的高危因素。流行病學(xué)研究顯示，包括潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥性腸病發(fā)生癌變的機制為：發(fā)炎黏膜增生性病變-不典型增生-癌變。由炎癥誘發(fā)的癌變機制包括：炎癥誘導(dǎo)活性氧和活性氮產(chǎn)生、誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定、基因突變后的倍性、增強細胞增殖、基因異常表達、抗凋亡、腫瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。這些機制可以直接或是間接的通過損傷重要的細胞成分(例如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))，促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。炎癥已經(jīng)成為癌癥的第七大特征，慢性炎癥的持續(xù)刺激是多種腫瘤產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。關(guān)鍵詞第3頁/共19頁AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌模型：氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextransodiumsulfate,DSS)小鼠模型是一種在致癌劑AOM和致炎劑DSS協(xié)同作用基礎(chǔ)上，由炎癥性腸病(inflmmatoryboweldisease,IBD)逐步發(fā)展為結(jié)直腸癌的炎癥相關(guān)性癌癥的研究模型。AOM/DSS模型能很好地模擬慢性腸道炎癥誘發(fā)癌癥的生理病理過程，近年來被廣泛用于炎癥相關(guān)性癌癥形成機制的研究。關(guān)鍵詞AOM/DSS模型誘導(dǎo)方法主要有兩種：“四步法”為AOM單劑量(7.5~12.5mg/kg)腹腔注射后，即時或1周后飼喂含1%~3%DSS飲水7d(也有4d)，之后改為正常飲水14d為1個循環(huán)，共循環(huán)3次；“兩步法”與前者的區(qū)別在于將3次循環(huán)的DSS處理縮短為單次循環(huán)，共兩步完成。四步法較兩步法加速了腫瘤的生長。第4頁/共19頁第5頁/共19頁psiCHECK2雙熒光素酶系統(tǒng)：由promega公司研發(fā)，雙熒光素酶報告基因在同一載體上。其中，海腎熒光素酶基因(hＲluc)為報告基因，螢火蟲熒光素酶基因(Fluc)為內(nèi)參基因，兩個熒光素酶基因都有自己的啟動子、終止位點，二者獨立表達互不干擾。該載體可快速準確地反應(yīng)微?。襈A(microＲNA，miＲNA)和ＲNA干擾(ＲNAinterference，RNAi)對靶基因的調(diào)控作用效果，但需要特定的熒光素酶檢測試劑盒和熒光素酶報告基因檢測儀。關(guān)鍵詞第6頁/共19頁第7頁/共19頁雙熒光素酶系統(tǒng)實驗方法：（1）PCR擴增靶基因的3’UTR，或直接合成結(jié)合位點序列；

（2）將上述DNA片段克隆至報告載體psiCHECK質(zhì)粒；

（3）合成miRNA模擬物；

（4）將報告載體與miRNA模擬物共轉(zhuǎn)待檢細胞；

（5）多功能酶標儀檢測報告基因的表達水平。第8頁/共19頁轉(zhuǎn)基因小鼠制備誘導(dǎo)炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌ELISA、WB、qRT-PCR檢測炎癥因子，HE染色病理觀察軟件分析miR-26a靶蛋白雙熒光素酶系統(tǒng)驗證Mimics高表達miR-26a，CCK-8、WB、qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)炎癥靶蛋白臨床樣本檢測課題設(shè)計第9頁/共19頁1.分別制備全身細胞過表達miR-26a、髓系細胞過表達miR-26a和腸上皮細胞過表達miR-26a的轉(zhuǎn)基因小鼠；利用AOM/DSS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌實驗分組正常小鼠對照組全身過表達組髓系細胞過表達組腸上皮細胞過表達組預(yù)期結(jié)果獲得不同部位高表達miR-26a的結(jié)直腸癌小鼠模型。第10頁/共19頁2.ELISA檢測各類轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中炎癥相關(guān)因子如：IL-1、IL-6、IL-10、IL-23、TGF-β、NF-kB、TNF-α、TNF-β等；WB和qRT-PCR檢測腫瘤組織中的炎癥相關(guān)因子；以及大腸組織切片觀察病理形態(tài)及腫瘤組織形態(tài)實驗分組正常小鼠對照組全身過表達組髓系細胞過表達組腸上皮細胞過表達組實驗方法ELISAWBqRT-PCRHE染色預(yù)期結(jié)果確定小鼠模型中miR-26a高表達對炎癥因子表達和癌癥發(fā)展的影響。第11頁/共19頁3.選擇靶基因搜索數(shù)據(jù)庫TargetScan和PicTar軟件預(yù)測miR-26a的靶基因，對兩種預(yù)測軟件獲得的靶基因取交集作為miR-29a的靶基因集合。查閱文獻尋找可促進炎癥反應(yīng)及細胞增殖的蛋白預(yù)期結(jié)果找到能夠促進炎癥反應(yīng)及細胞增殖的miR-26a靶蛋白。第12頁/共19頁4.在293T細胞中以psiCHECK2.2雙熒光素酶系統(tǒng)驗證靶基因?qū)嶒灧纸MpsiCHECK2空載與陰性對照psiCHECK2空載與miR-26amimicspsiCHECK2-3’UTR與陰性對照psiCHECK2-3’UTR與miR-26amimics預(yù)期結(jié)果海腎熒光素酶表達，螢火蟲熒光素酶表達；海腎熒光素酶表達，螢火蟲熒光素酶表達；海腎熒光素酶表達，螢火蟲熒光素酶表達；海腎熒光素酶低表達，螢火蟲熒光素酶表達；驗證軟件尋找的靶基因確實能與miR-26a特異性結(jié)合。第13頁/共19頁5.用mimics高表達SW620細胞中的miR-26a，CCK-8檢測細胞增殖，WB和qRT-PCR檢測靶蛋白、各種炎癥相關(guān)因子的表達情況和mRNA水平實驗分組正常對照組陰性對照組Inhibitor組實驗方法CCK-8WBqRT-PCR預(yù)期結(jié)果miR-26a的高表達抑制細胞增殖，減少靶蛋白和炎癥因子的表達，體外驗證靶蛋白。第14頁/共19頁6.在三種不同的轉(zhuǎn)基因小鼠大腸組織中WB檢測靶蛋白的表達情況實驗分組正常小鼠對照組全身過表達組髓系細胞過表達組腸上皮細胞過表達組實驗方法WB預(yù)期結(jié)果體內(nèi)驗證靶蛋白第15頁/共19頁7.取不同病理期的結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織，檢測miR-26a和炎癥因子表達情況，病理切片分析miR-26a、炎癥因子濃度和腫瘤發(fā)展情況，以正常體檢患者外周血和癌旁組織為正常對照實驗分組正常體檢樣品不同病理期臨床樣品實驗方法ELISAWBqRT-PCRHE染色免疫組化預(yù)期結(jié)果了解臨床樣本中miR-26a與炎癥因子、腫瘤發(fā)展的關(guān)系。第16頁/共19頁預(yù)期結(jié)果臨床樣本中隨著炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)展，m