高原肺水腫相關(guān)9個SNPs多態(tài)性位點檢測分析,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

高原肺水腫相關(guān)9個SNPs多態(tài)性位點檢測分析,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文當(dāng)前,高原肺水腫(High-altitudepulmonarye-dema,HAPE)發(fā)病機制仍然不清楚,學(xué)者們提出HAPE是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,具有遺傳易感性。世界各個研究小組分別對腎素-血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶系統(tǒng)相關(guān)基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因、酪氨酸羥化酶基因、血管內(nèi)皮生長因子基因、肺泡外表活性蛋白基因、2-腎上腺素能受體基因、熱休克蛋白70家族基因的諸多多態(tài)性位點與HAPE的易感性進行了相關(guān)性研究,但與HAPE發(fā)病密切相關(guān)的基因以及多態(tài)性位點報道不一。前期,課題組利用AffymetrixSNPArray6.0芯片,對2018年5月至2020年7月在青海省玉樹地區(qū)執(zhí)行援建任務(wù)時來自平原地區(qū)的40例HAPE患者和33例健康對照者進行全基因組SNP分型,通過PLINK軟件對芯片結(jié)果進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wideassociationstudy,GWAS),挑選出在病例組與對照組間有顯著差異的SNP位點,功能學(xué)分析表示清楚這些位點附近的基因與HAPE的發(fā)生機制相關(guān)。本研究選取9個SNPs位點,采用改進多重高溫連接酶反響(improvedmultipleligasedetectionreaction,iMLDR)方式方法檢測這些多態(tài)性位點,并分析與HAPE的相關(guān)關(guān)系。1、材料與方式方法1.1研究對象采用中華醫(yī)學(xué)會頒布的HAPE診斷標(biāo)準(zhǔn),收集2018年5月~2020年7月在青海省玉樹地區(qū)執(zhí)行援建任務(wù)時的HAPE患者135例,患者均在玉樹州人民醫(yī)院進行搶救和恢復(fù)治療。HAPE患者均為無親緣關(guān)系的平原漢族居民,平常體健,無心血管及呼吸系統(tǒng)等其他器官疾病,且發(fā)病前從將來過高原。對照組選擇寓居區(qū)域海拔、年齡、性別、勞動強度等與HAPE組相匹配的漢族健康對照者137例。采用調(diào)查表收集研究對象的一般情況,包括既往史、家族史、生活方式等,入選者知情同意后簽字。分別抽取研究對象靜脈血各5mL,EDTA鈉抗凝,室溫放置15min,離心(2000r/min)10min,汲取上層血漿,置液氮保存?zhèn)溆?有核細胞層經(jīng)紅細胞裂解液處理后,參加celllysisbuffer(GentraPuregeneBloodKit)室溫保存。該項研究獲得青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。1.2儀器與材料DU800核酸檢測儀、5415D高速離心機(Eppen-dorf公司),DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠),UVP凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)。GentraPuregeneBloodKit血液基因組提取試劑盒(Qiagen公司)。其他為國產(chǎn)分析純試劑。1.3候選位點前期AffymetrixSNP6.0芯片結(jié)果提示HAPE與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫和炎癥、介入脂質(zhì)代謝及維持胞內(nèi)葡萄糖平衡、鉀通道、鈣轉(zhuǎn)運、細胞連接等眾多基因相關(guān)[4]?；诖?挑選9個SNP位點(表1),進行關(guān)聯(lián)分析。1.4實驗方式方法1.4.1基因組DNA提取:采用GentraPuregeneBloodKit基因組提取試劑盒,提取樣本外周血白細胞基因組DNA。DNA樣本經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對其進行完好度檢查,核酸檢測儀測定濃度,并將樣本DNA稀釋到工作濃度(5~10ng/L)。1.4.2基因分型:SNP位點的檢測使用iMLDR法,所需PCR擴增引物(表2)和多重單堿基延伸反響延伸引物(表3)均由上海天昊生物科技有限公司設(shè)計,在上海生工生物科技有限公司合成,按要求稀釋到指定濃度。分型實驗委托上海天昊生物科技有限公司進行。反響體系(10L)包含1GC-Ibuffer,3.0mMMg2+,0.3mMdNTP,1UHotStarTaqpoly-merase,1L樣本DNA和1L多重PCR引物。PCR循環(huán)程序:95℃2min;11cycles(94℃20s,65℃-0.5℃/cycle40s,72℃90s);24cycles(94℃20s,59℃30s,72℃90s);72℃2min;4℃60min;在PCR產(chǎn)物中參加試劑盒中的ExoI/SAP酶1L,37℃溫浴1h,然后75℃滅活15min;取試劑盒中的10連接緩沖液2L、高溫連接酶0.2L、連接引物混合液1L與純化后多重PCR產(chǎn)物3L、ddH2O3.8L混勻。連接程序:38cycles(94℃1min,56℃4min);4℃60min;取0.5L稀釋后的連接產(chǎn)物,與0.5LLiz500SIZESTANDARD、9LHi-Di混勻,95℃變性5min后上ABI3130XL測序儀;收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper4.1(AppliedBio-systems,USA)分析并輸出結(jié)果?！颈?、3略】1.5統(tǒng)計學(xué)處理方式方法運用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律檢測樣本代表性,醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件SPSS17.0處理基因型和等位基因頻率結(jié)果。計數(shù)資料各百分率比擬用卡方檢驗,檢驗顯著性水平,P0.05。2、結(jié)果2.1候選SNPs分型結(jié)果本實驗采用iMLDR多重SNP分型試劑盒對272個樣本的9個SNP進行分型(圖1)。2.2候選SNPs基因型與等位基因頻率經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)所有SNP位點均符合Hardy-Weinberg檢驗平衡定律。rs10932688、rs12655827、rs2021869、rs4572038、rs4984295、rs11581271、rs17052028、rs3009568的基因型和等位基因頻率在HAPE組和對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。rs4906864的基因型TT在HAPE組(14.8%)和對照組(0.08%)組間差異有顯著性(P0.05),oddsratio為0.425(0.187~0.966);等位基因T在HAPE組(38.5%)和對照組(29.9%)組間差異有顯著性(P0.05),oddsratio為0.682(0.477~0.973)(表4)?！颈?略】3、討論我們前期的研究結(jié)果提示,HAPE與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫和炎癥、介入脂質(zhì)代謝及維持胞內(nèi)葡萄糖平衡、鉀通道、鈣轉(zhuǎn)運、細胞連接等眾多基因相關(guān)。本研究針對前期工作挑選出的9個SNP位點與HAPE的相關(guān)關(guān)系進行研究,僅發(fā)現(xiàn)rs4906864的基因型TT和等位基因T在組間差異有顯著性。rs4906864位于編碼-