DB21-T3698-2023飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測

ICS65.12021CCSB4621遼 寧 省 地 方 標 準DB21/T3698—2023飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測MethodfordeterminationofClostridiumbutyricuminfeeds20232023022820230328遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3698DB21/T3698—2023DB21/T3698—2023DB21/T3698—2023目 次范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1縮略語 1稀釋液、培養(yǎng)基及試劑 1設備和實驗器材 1檢驗程序 2采樣 3試樣的制備 3操作步驟 3確證試驗 4結(jié)果計算與報告 5附錄附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑 7附錄B（資料性）細菌DNA提取 9I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。。我們將及時答復并認真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復審。2242347862。9號，聯(lián)系電話IIII飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測范圍本文件規(guī)定了飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測方法。本文件適用于各種飼料添加劑各組分中丁酸梭菌的檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T4789.2食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FTG FluidThioglycollate，液體硫乙醇酸鹽5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑0.85%滅菌生理鹽水。AA.1。AA.2。細菌生化鑒定試劑盒。DNACICC10390。實驗室用水:GB/T66826設備和實驗器材16.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。漩渦震蕩器：0～2800rpm。顯微鏡：10006.4高壓滅菌鍋：105～134℃。無菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm。250mL。無菌玻璃或塑料涂布棒。無菌吸管：1mL（0.1mL）10mL（0.5mL）。微生物鑒定儀。6.10電子天平：感量為0.1g、0.01g、0.0001g。4pH0.1。量筒：250mL。PCR電泳儀。電泳儀。凝膠成像儀。10μL、100μL、1000μL、10000μL。7檢驗程序丁酸梭菌檢驗程序見圖1。2圖1丁酸梭菌檢驗程序8采樣菌器皿。采樣后，樣品應及時送至微生物檢驗室進行檢測。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。9試樣的制備按照GB/T20195進行。菌器皿。采樣后，樣品應及時送至微生物檢驗室進行檢測。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。9試樣的制備按照GB/T20195進行。10操作步驟檢樣制備與稀釋以無菌操作取試樣25g(mL)，注入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)1min～2min或置振蕩器中振蕩30min，制成1︰10的初始菌懸液。吸取1︰10的初始菌懸液1mL，加入9mL0.85%滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1︰100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述操作順序做進一步的10倍系列遞增稀釋的稀釋度。接種和培養(yǎng)選擇2個～3個適宜稀釋度，每個梯度3個平行，用無菌移液器分別吸取0.1mL稀釋液，接種到改良FTG7.0±0.215℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h±1h。菌落計數(shù)及篩選3培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個～300個之間的平板計數(shù)，若平板中有較大片狀菌落生長時，則不宜采用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。培養(yǎng)后的平板內(nèi)的培養(yǎng)基顏色由粉色變成淡黃色，典型丁酸梭菌菌落形態(tài)呈端圓，白色，稍凸，不透明，表面菌落稍有不規(guī)則。確證試驗菌種制備自平板上挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃嚴格厭氧培養(yǎng)24h±1h，從平板上選取至少5個良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進行確證試驗。形態(tài)觀察生化確認試驗表1丁酸梭菌生化特征PCR表1丁酸梭菌生化特征PCRDNA用商用細菌基因組DNA（附錄提取試樣擴增引物序列上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；4特征結(jié)果特征結(jié)果乳糖+蜜二糖+水楊苷+松三糖-木糖+棉子糖+山梨醇-鼠李糖-淀粉水解+明膠水解-注：+：陽性；-：陰性。下游引物：R5′-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3′。PCR反應體系如表2所示。預計擴增產(chǎn)物大小為171bp。PCRPCR反應體系見表2。2PCR試劑使用量（μL）2×TaqMasterMix5上游引物（20μM）0.5下游引物（20μM）0.5模板（100ng/μL）1ddH2O3總體積10程序設定530℃30s30s；⑤保溫：4℃10min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設為35。電泳用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠，加入Gelred染料。取5μLPCR擴增產(chǎn)物，進行點樣。用DNA分子量標記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳30min，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。確證結(jié)果171bp171bp12結(jié)果計算與報告12.1菌落計數(shù)只計算符合10.3的菌落。5g（mL）樣品中的菌數(shù)，按式（1）計算：A=B×C×? (1)5式中：5A—測定的丁酸梭菌菌落數(shù)，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落總數(shù)。C—5個鑒定的菌落中確認為丁酸梭菌的菌落數(shù)。f—稀釋倍數(shù)。最終結(jié)果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。示例：含有丁酸梭菌的樣品中106稀釋液在培養(yǎng)基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落為100個，取5個鑒定，證實為丁酸梭菌的是4個，由1g飼料中含丁酸梭菌菌數(shù)為：100×4×106=8.0×107CFU/g512.2樣品中丁酸梭菌菌數(shù)的計算方法與報告（30個～300個之間），通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的丁酸梭菌菌數(shù)N：N= 5? (2)Vn1+0.1n2d式中：N 樣品中丁酸梭菌菌落數(shù)；∑a 所有平板經(jīng)確證后的丁酸梭菌菌數(shù)的總和；V 平板的接種體積，單位為毫升（mL）；n1 第一個稀釋度的平板數(shù)；n2 第二個稀釋度的平板數(shù)；d 第一個稀釋度的稀釋因子（d）。按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則將計算出的結(jié)果保留至兩位有效數(shù)字，也可將樣品的丁酸梭菌菌落數(shù)記錄為1.0--9.9乘以10的指數(shù)冪表示。報告每mL或每g樣品的丁酸梭菌估計數(shù)，單位CFU/g（mL）。示例1：若第一個稀釋度（10-4）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為137和201，第二個稀釋度（10-5）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為34和56，則：N=式中：

= 428137+201+34+560.1×2+0.1×2×10?4137+201+34+560.1×2+0.1×2×10?4

=19454545按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中含丁酸梭菌估計數(shù)為19454545或.907FUgL。示例2：（052135，則：N=121+1350.1×2×10?5

= 2560.000002

=128000000式中：按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中丁酸梭菌估計數(shù)為128000000CFU/g（mL）或1.3×108CFU/g（mL）。6附錄 A（規(guī)范性）FTG成分胰蛋白胨 15g酵母粉 5g葡萄糖 10g硫代乙醇酸鈉 3gL-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5g氯化鈉 2.5g瓊脂 20g刃天青 0.001g蒸餾水 1000mL制法將上述成分加于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0±0.2，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15min。革蘭氏染色革蘭氏染色結(jié)晶紫染色液成分結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液1g20mL80mLA.2.1.2制法將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液成分碘碘化鉀蒸餾水gg300mLA.2.2.2制法將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.2.3沙黃復染液7成分沙黃 0.25g95%乙醇 10mL蒸餾水 90mL制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.2.4染色法11s，水洗；滴加沙黃復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。88附錄 B（資料性）DNADNA細菌培養(yǎng)細菌接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過夜。細菌收集取1mL培養(yǎng)物于1.5mL無菌EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mLTEH.0中或dO菌體裂解加入6μL50mg/mL的溶菌酶，372h。再加2mol/LNaCl50μL，10%SDS110μL，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃過夜（此時菌液應為透明粘稠液體）。抽提10min，12000rpm離心10min