EVs檢測方法整理

-.z.A、EVs外部特征〔大小和外表蛋白〕檢測方法Dynamiclightscattering(DLS)：動態(tài)光散射技術(shù)原理：通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得到樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。"動態(tài)〞是因為樣品中的分子不停地做布朗運動，正是這種運動使散射光產(chǎn)生多普勒頻移。步驟：首先根據(jù)散射光的變化，機多普勒頻移測得溶液中分子的擴散系數(shù)D，再由D=KT/6πnr可求出分子的流體動力學(xué)半徑r(K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，n為溶液的粘滯系數(shù))關(guān)鍵參數(shù)：濃度〔不能太濃，易發(fā)生二次散射，導(dǎo)致檢測信號減弱〕/光到樣品以及散射光到檢測器的距離。測量粒徑范圍：1nm-6um優(yōu)點：樣品制備簡單，不需要特殊處理，可以反映樣品分子真實狀態(tài)；速度快，樣品可回收；靈敏度高。缺點：分析粒徑差不多的樣品比擬準(zhǔn)確。對于樣品顆粒大小差異大的，并不是很準(zhǔn)確。如果樣品中有比擬多大顆粒樣品，小顆粒樣品的測量結(jié)果會受影響；不能檢測熒光信息。Nanoparticletrackinganalysis(NTA)：納米顆粒跟蹤技術(shù)原理：與DSL類似。利用激光光源照射納米顆粒懸浮液，利用全黑背景則功能強信號，可以清晰觀察到帶有散射光的顆粒的布朗運動?？梢赃M(jìn)展計數(shù)統(tǒng)計、濃度檢測。具有熒光模式。測量粒徑范圍：10nm-2000nm〔有文獻(xiàn)報道能檢測EV的最小粒徑為70nm〕樣品濃度范圍：0.5E+6-1E+10/cm3,相比于DLS更低。推薦分析1000-10000個。缺點：1、熒光模式和散射模式是分開的。2、計術(shù)限制，檢測的是二維平面信息，而Z軸方向是檢測不到。Flowcytometry:流式細(xì)胞儀粒徑檢測極限：300-500nmRamanMicrospectroscopy〔RM〕：拉曼光譜原理：基于非彈性散射〔改變方向和頻率〕。優(yōu)點：可用于EVs亞型的鑒定缺點：價格昂貴，技術(shù)要求高；樣品制備和采集時間長，10-100個/小時；信號弱，非彈性散射信號強度小于彈性散射信號的1/10000；測量重復(fù)性差；EVs置于高劑量的光線下，會產(chǎn)生光反響，且是不可逆的。AtomicForceMicroscopy(AFM):原子力顯微鏡原理：利用微小探針與待測物之間交互作用力，來呈現(xiàn)待測物的外表的物理特性。將一個對力極為敏感的微懸臂的一端固定，另一端固定針尖。當(dāng)針尖再樣品外表掃描時，因針尖尖端原子與樣品外表原子存在的范德華力，使微懸臂產(chǎn)生微小彎曲。檢測懸臂彎曲所造成的微笑位移量，得到樣品外表信息。缺點：EV的固定可能會影響其拓?fù)錁?gòu)造，結(jié)果會受到樣品制備模式的影響；檢測結(jié)果受微懸臂探頭影響非常大，針尖的卷積效應(yīng)可能會使橫向結(jié)果的偏差很大；成像范圍太小，只要~10μm*10μm；檢測速度慢，測試一個樣品通常要1小時以上。ResistivePulseSensing(RPS)：電阻脈沖傳感原理：當(dāng)高電阻率的絕緣顆粒流經(jīng)檢測微孔時，會置換微孔中等體積的低電阻率電解質(zhì)溶液，使得檢測微孔電阻發(fā)生改變，并在檢測微孔兩端產(chǎn)生一個電流脈沖值或電壓脈沖值。脈沖信號得個數(shù)反映流經(jīng)檢測微孔得顆粒數(shù)目，脈沖信號的幅值大小反映顆粒的尺寸大小。另外，當(dāng)顆粒在電解質(zhì)溶液中均勻分布且溶液流經(jīng)檢測微孔的速度一定時，可以用于濃度檢測。測量粒徑范圍：100nm-100um，測量懸浮液顆粒絕對大小和濃度。缺點：樣品形態(tài)，孔徑大小和樣品的導(dǎo)電性均會影響結(jié)果。不能檢測生理鹽水狀態(tài)下的樣品，因此限制生物樣品的使用。中間孔徑小于1um可調(diào)電阻脈沖傳感〔TRPS〕:A、由于EVs的粒徑異質(zhì)性很大，較大的孔徑可能會堵塞微孔。B、標(biāo)準(zhǔn)品的大小需要與樣品尺寸一樣，這對于未知樣品檢測不夠靈活。FieldFlowFractionation(FFF)：場流別離技術(shù)原理：用于大分子、膠體和微粒的別離。在相距很近的上下平板間構(gòu)成扁平帶狀流道，載流液流于其中。載流為層流，其流型為拋物線型，中心線上速度最大。側(cè)向場從側(cè)面垂直與流動方向施加，側(cè)向場導(dǎo)致不同成分處在距下壁不同位置上，從而有不同移動速度，在此前提下進(jìn)展別離。通常矩形流道寬高比一般大于100：1。可分為電場場流別離、熱場場流別離、沉降場流別離和流場場流別離。Cryo-TEM:冷凍電鏡冷凍電鏡技術(shù)結(jié)合受體特異性金標(biāo)記可用于EVs表型描述。冷凍電鏡不需要對樣品進(jìn)展固定和脫水處理，因此EV的形態(tài)是真實狀態(tài)下的。9、ScanningElectronMicroscopy掃描電子顯微鏡：原理：用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的原子相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。樣品需要固定和脫水，因此形狀呈現(xiàn)一種扭曲的杯狀。SingleEVAnalysis(SEA)Method光鏡單個EV檢測方法：E*oCounter:細(xì)胞外囊泡檢測系統(tǒng)類似ELISA方法，用抗體捕獲外泌體.。但是CD9CD63CD81在外泌體的表達(dá)量均達(dá)不到100%，因此會損失很多信息。納米流式檢測儀〔FlowNanoAnalyzer)原理：和傳統(tǒng)流式有點類似，均是靠激光激發(fā)顆粒產(chǎn)生光信號。不同的是，納米流式利用的是瑞利散射原理，主要檢測200nm以下的顆粒。優(yōu)點：散射檢測范圍7~1000nm〔EV檢測下限為40nm)，可以同時檢測樣品的粒徑、濃度、外表蛋白信息以及內(nèi)容物。缺點：熒光標(biāo)記的樣品需要超速離心去除游離染料。B、EVs內(nèi)容物檢測技術(shù)傳統(tǒng)核酸的提取與檢測RNA提?。悍勇确鲁樘幔禾崛r間長，步驟繁瑣；純度高；商品化柱提法檢測：PCR;RT-PCR;電泳；ne*tgenerationsequencing(NGS)。DropletPCR原理：在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進(jìn)展微滴化處理，即將含有核酸分子的反響體系分成數(shù)萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待測核酸靶分子，或者含一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后，對每個微滴的熒光信號進(jìn)展逐一分析，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0。根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子起始拷貝數(shù)或濃度。技術(shù)優(yōu)勢：靈敏度高達(dá)0.001%；能克制核酸降解的不利影響；所需樣本量少；可統(tǒng)計突變率；缺點：模板添加量要求較高〔濃度過高導(dǎo)致全部孔都有信號，濃度過低陽性信號孔過少，均不準(zhǔn)確〕；對引物特異性要求高。MicrofluidicsforOn-ChipE*tractionandDetection〔用于芯片內(nèi)提取和檢測的微流體〕樣品小于100ul；檢測時間小于3小時。Ion-E*changeNanodetector〔離子交換納米檢測器〕原理：通過交織換能器在交流電流作用下壓電晶體外表產(chǎn)生外表聲波(saw)，實現(xiàn)了電動勢的裂解。C、EVs蛋白的檢測技術(shù)細(xì)胞外囊泡的蛋白主要來源于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，并不來自細(xì)胞器。特別關(guān)注跨膜蛋白和包漿蛋白。外泌體膜蛋白主要有四分子交聯(lián)體大家族〔CD9/CD63/CD81〕，在膜轉(zhuǎn)運和生物合成成熟起作用。但是這些蛋白并不只是在外泌體中存在。微囊泡膜蛋白主要有整合蛋白、選擇蛋白和CD40配體。細(xì)胞外囊泡還包括特異的跨膜蛋白受體(皮生長受體〔EGFRs〕)和黏附蛋白〔上皮細(xì)胞黏附分子EpCAM〕細(xì)胞外囊泡囊內(nèi)蛋白：TSG101/ALI*/anne*ins/Rabs，在膜轉(zhuǎn)運中起作用；骨架蛋白〔肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白〕；分子伴侶HSPs；代謝酶GAPDH。WesternBlottingandELISA質(zhì)譜分析高通量肽譜分析，分析的關(guān)鍵是進(jìn)展肽別離〔SDS/二維相色譜/等電聚焦分餾〕優(yōu)點：高通量、定量和蛋白組學(xué)分析缺點：時間長〔天〕傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)+微球富集法缺點：不能進(jìn)展單一EV檢測；得到的結(jié)果是平均值。優(yōu)點：可進(jìn)展高通量檢測小顆粒流式細(xì)胞術(shù)〔100nm〕微型核磁共振原理：由于大多數(shù)生物實體缺乏鐵磁性背景，當(dāng)它們被納米磁珠〔MNPs〕靶向時，此時它們與原生的生物實體形成強烈比照。在基于核磁共振(NMR)的磁檢測中，將MNPs置于NMR磁場中，會產(chǎn)生局部磁場，改變周圍水分子的橫向弛豫速率，從而放大分析信號。檢測靈敏度是westernblot和ELISA的~103倍。Nano-plasmonicE*osome(nPLE*)Sensor〔納米等離子體外泌體傳感器〕原理：基于外表等離子體共振：1、根據(jù)法國物理學(xué)家菲涅爾所提出的光學(xué)定理：可知，當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì)，入射角增大到*一角度，使折射角到達(dá)90°時，折射光將完全消失，而只剩下反射光，這種現(xiàn)象叫做全反射。〔圖1〕當(dāng)以波動光學(xué)的角度來研究全反射時，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過光疏介質(zhì)約一個波長的深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波；2、等離子體通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。把金屬外表的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體，這實際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受電磁干擾時，金屬內(nèi)部的電子密度分布會變得不均勻。因為庫侖力的存在，會將局部電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域，被吸引的電子由于獲得動量，故不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運動一段距離，之后電子間存在的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會形成一種整個電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)展，進(jìn)而形成的震蕩稱等離子震蕩，并以波的形式表現(xiàn)，稱為等離子波。3、我們在前面提到光在棱鏡與金屬膜外表上發(fā)生全反射現(xiàn)象時，會形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中，而在介質(zhì)〔假設(shè)為金屬介質(zhì)〕中又存在一定的等離子波。當(dāng)兩波相遇時可能會發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與外表等離子波發(fā)生共振時，檢測到的反射光強會大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到外表等離子，入射光的大局部能量被外表等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少?？梢詮淖髠?cè)的反射光強響應(yīng)曲線看到一個最小的尖峰，此時對應(yīng)的入射光波長為共振波長，對應(yīng)的入射角θ為SPR角。電子吸收光能量，從而使反射光強在一定角度時大大減弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金外表折射率變化而變化，而折射率的變化又與金外表結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對生物反響過程中SPR角的動態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。外表等離子共振〔SPR〕優(yōu)點；檢測靈敏度是westernblot和ELISA的102~104倍；不同蛋白檢測更準(zhǔn)確；檢測時間小于30min.；可用于高通量檢測；7、IntegratedMagn