單核增生李斯特氏菌檢測

單核增生李斯特氏菌檢測第1頁/共43頁李斯特氏菌屬

李斯特氏菌屬（Listeria

）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學(xué)研究表明，其分為六個種：單核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）綿羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeriaivanovii）英諾克（無害）李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌屬的六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關(guān)。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。第2頁/共43頁生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及染色特征革蘭氏陽性；小的、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2μm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個、成短鏈、細(xì)胞彼此連成V形，或成群的細(xì)胞沿長軸方向平行排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃周生鞭毛運(yùn)動，在37℃只有較少的鞭毛或1根鞭毛；無芽孢、無莢膜。第3頁/共43頁第4頁/共43頁生物學(xué)特性---培養(yǎng)特性兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動。生長溫度范圍為2-42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為30--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。第5頁/共43頁生物學(xué)特性---培養(yǎng)特性在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。

第6頁/共43頁生物學(xué)特性---生化反應(yīng)氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。第7頁/共43頁生物學(xué)特性---血清型根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。第8頁/共43頁生物學(xué)特性---抵抗力該菌對理化因素抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長期存活；對堿和鹽抵抗力強(qiáng)，60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌；濕熱滅菌（121℃，至少15min）和干熱滅菌（160-170℃，至少1hr）可殺滅該菌，對紫外線和γ射線敏感；該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產(chǎn)生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。第9頁/共43頁流行病學(xué)分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲第10頁/共43頁流行病學(xué)

據(jù)報道，有1-10%的人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。相關(guān)食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、發(fā)酵過的生肉制作的香腸、生的和加工過的禽肉、各種生的肉類、生的和煙熏的魚肉。約有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。第11頁/共43頁致病性及其治療該病的臨床表現(xiàn)，健康成人個體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成的腦膜炎的致死率可高達(dá)70%，敗血癥的死亡率達(dá)50%，圍產(chǎn)期或新生兒感染的死亡率超過80%，懷孕期婦女的感染，母親通常能存活下來。抗生素治療，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。第12頁/共43頁感染人群感染劑量未知，但與該菌的毒力和易感人群的年齡、免疫狀態(tài)有關(guān)。易感者：孕婦/胎兒—圍產(chǎn)期和新生兒的感染；免疫缺損者；癌癥病人—

尤其是白血病的患者；年紀(jì)較大的人；沒有免疫缺陷的健康的人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌的食品后，也有患病的危險。第13頁/共43頁致病機(jī)理單增李氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，它的致病性與毒力機(jī)理如下：

1、寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；

2、抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物（為殺菌的毒性游離基團(tuán)）分解；

3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，有α和β兩種，為毒力因子。第14頁/共43頁實驗室危害不是一種普遍的與實驗室相關(guān)的傳染病，目前只有少數(shù)有報道的案例發(fā)生；直接攝取是最普遍的一種感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度的氣溶膠中，也可通過眼睛和破損的皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)造成感染。第15頁/共43頁注意事項生物安全2級，操作時應(yīng)有相應(yīng)的防污染設(shè)施，在進(jìn)行可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成；在直接接觸有感染性的材料時，必須穿著實驗服，戴手套和護(hù)目鏡；懷孕的婦女應(yīng)避免接觸傳染物。第16頁/共43頁操作要求濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護(hù)服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周邊向中心加，在清理之前要留充足的接觸時間（30min）；廢棄：在廢棄前應(yīng)先采取凈化措施，高壓蒸汽滅菌、化學(xué)消毒、焚燒等；儲存：在有適當(dāng)標(biāo)記的密封容器內(nèi)儲存。第17頁/共43頁25g樣品+225mlFB1增菌液30℃25h±1h1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2增菌液30℃25h±1hVIDAS快速篩選

陰性，報告結(jié)果

陽性，繼續(xù)鑒定選擇性培養(yǎng)基（顯色培養(yǎng)基、OXA、PALCAM）

挑選可疑菌落，接種TSA-YE35℃24h

接種TSB-YE藍(lán)色菌落檢驗典型運(yùn)動檢驗過氧化氫酶試驗革蘭氏染色溶血試驗動力試驗協(xié)同溶血試驗血清學(xué)試驗

報告結(jié)果單核增生李斯特氏菌檢測流程（SN/T0184.1-2005）

API鑒定試驗或生化試驗?zāi)蛩孛杆?，硝酸鹽還原，葡萄糖，甘露醇，麥芽糖，鼠李糖，木糖，七葉苷，TSIMR-VP第18頁/共43頁檢測程序---增菌

目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、Fraser肉湯（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）第19頁/共43頁半量Fraser肉湯和Fraser肉湯具有選擇性和區(qū)別性。加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉靈，與培養(yǎng)基中的鐵離子反應(yīng)，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。第20頁/共43頁UVMUVM只有選擇性沒有區(qū)別性加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉靈，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反應(yīng)。第21頁/共43頁LEB和BLEB只有選擇性沒有區(qū)別性LEB是在TSB-YE的基礎(chǔ)上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入的丙酮酸鈉，有助于受損細(xì)胞的恢復(fù)；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反應(yīng)BLEB是在LEB基礎(chǔ)上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉第22頁/共43頁檢測程序---分離分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等。分離原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉靈，產(chǎn)生七葉苷，與鐵離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)而使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應(yīng)還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。第23頁/共43頁OXA平板/(palcam)單核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培養(yǎng)第24頁/共43頁OXA平板無害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培養(yǎng)第25頁/共43頁顯色平板第26頁/共43頁檢測程序---鑒定藍(lán)色菌落檢驗（Henryillumination）典型運(yùn)動：相差顯微鏡，輕微旋轉(zhuǎn)或翻跟頭動力試驗：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗：穿刺接種血平板硝酸鹽還原試驗：5天，陰性糖發(fā)酵試驗：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應(yīng)均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其他種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義第27頁/共43頁動力試驗第28頁/共43頁

血平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培養(yǎng)第29頁/共43頁

血平板無害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培養(yǎng)第30頁/共43頁

血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培養(yǎng)第31頁/共43頁單增李斯特菌無害李斯特菌綿羊李斯特菌馬紅球菌金葡協(xié)同溶血試驗第32頁/共43頁單核增生李斯特氏菌檢測流程(GB/T4789.30-2010)檢樣25g(或25mL)樣品+LB1增菌液225mL，均質(zhì)0.1mL+10mLLB2增菌液李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基PALCAM瓊脂接種木糖、鼠李糖，36±1℃，24h；同時于TSA-YE平板劃線純化，30±1℃，24h~48h木糖-，鼠李糖+鑒定結(jié)果報告30±1℃，24h30±1℃，18~24h36±1℃，24h~48h第33頁/共43頁單核增生李斯特氏菌檢測流程(FDA)25g樣品+225mlBLEB基礎(chǔ)（加入丙酮酸鈉）

加入萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮30℃4hr劃線接種OXA平板30℃

24hr和48hr

科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基TSA-YE分純35℃

24hr-48hr

35℃

24hr過氧化氫酶試驗、革蘭氏染色、溶血試驗、糖發(fā)酵試驗（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr報告結(jié)果35℃18-24hr第34頁/共43頁方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）藍(lán)色菌落；典型運(yùn)動；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；尿素酶試驗；硝酸鹽還原；MR-VP；三糖鐵；糖發(fā)酵；動力試驗；協(xié)同溶血*；血清學(xué)檢驗*；小鼠毒力試驗*無未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-2003EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）藍(lán)色菌落；三糖鐵；動力試驗；染色鏡檢（革蘭氏染色、典型運(yùn)動）；生化特性（溶血反應(yīng)、硝酸鹽還原、尿素酶、MR-VP、糖發(fā)酵）；小鼠毒力試驗；協(xié)同溶血無LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三種抑菌劑（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七葉靈+Fe3+推薦BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria藍(lán)色菌落*；典型運(yùn)動或動力試驗；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；硝酸鹽還原*；糖發(fā)酵；協(xié)同溶血；血清學(xué)檢驗；小鼠毒力試驗*篩選、鑒定都可以使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步鑒定：純菌菌落形態(tài)；典型運(yùn)動；生化鑒定：MICRO-ID?

Listeria或Api?

Listeria或BAM等方法中的傳統(tǒng)生化反應(yīng)；協(xié)同溶血遺傳鑒定：核糖體RNA檢測；PFGE*篩選用的快速方法必須經(jīng)過確認(rèn)后才可使用鑒定中用到MICRO-ID?

、Api?、GenProbeAccuProbe?、GENE-TRAK?各官方方法比較第35頁/共43頁各官方方法比較方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM典型運(yùn)動或動力試驗；溶血試驗；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鑒定試劑盒*；過氧化氫酶*；革蘭氏染色*；協(xié)同溶血*；血清學(xué)試驗*作為鑒定的可選步驟，允許使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe?ISO11290-1:19