顯微操作技術熒光顯微鏡技術的特點和應用

關于顯微操作技術熒光顯微鏡技術的特點和應用第一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一熒光顯微鏡的種類透射式落射式第二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一和傳統(tǒng)顯微技術相比,熒光顯微技術具有以下優(yōu)點:(1)熒光顯微鏡所用光源的波長比傳統(tǒng)顯微鏡光源的波長短1/2,因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率的極限(2)熒光顯微鏡技術具有高度靈敏性和專一性.它所用染料的量是極其微小的,只相當于傳統(tǒng)顯微技術中染料消耗量的幾千分之一.第三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一(3)熒光顯微鏡能夠直接顯示細胞內的生物化學成分,并且顯示的彩色效果很明亮,極易觀察,極易進行定量分析,而且能以極低濃度的染料檢測出含量極微的物質.(4)隨著新的熒光染料的發(fā)明,可不斷擴大被測物質的范圍.第四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一生物學材料，有各種產生熒光:1.自發(fā)熒光:或原發(fā)熒光細胞組織中自然存在的某些物質可被激發(fā)產生熒光2.誘發(fā)熒光材料中的某些物質經一定的化學處理后，可轉化為熒光色團，由此被誘發(fā)產生熒光。最常見的是甲醛誘發(fā)蛋白質中所含的芳香乙胺基團轉化為熒光色團。戊二醛也能誘發(fā)熒光第五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一3熒光染料染色：應用含熒光色團的物質作為染料，使與生物組織中和該物質有特殊親和力的成分相結合，即可被激發(fā)熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素。許多常規(guī)染色劑(如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水溶性苯胺藍等)兼有熒光染料的性能第六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一1.DNA研究用細胞熒光測定技術測量DNA,是熒光顯微技術和細胞光度技術相結合的產物,標志著前者由定性向定量測定發(fā)展.第七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一吖啶橙3，6－（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式C17H19N3·HCl·ZnCl?,分子量438.12g/mol,是一種熒光色素，其檢測激發(fā)濾光片波長488nm,阻斷濾光片波長515nm。第八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一吖啶橙染色原理:吖啶橙可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光。其激發(fā)峰為492nm，熒光發(fā)射峰為530nm（DNA）、640（RNA），它與雙鏈DNA的結合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光（502nm）激發(fā)下，細胞核發(fā)亮綠色熒光（約530nm），胞質RNA發(fā)橘紅色熒光（>580nm）。第九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一它與細胞中DNA和RNA結合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。第十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一體外培養(yǎng)的肝癌細胞吖啶橙熒光染色可見含DNA的細胞核顯示黃綠色熒光，含RNA的細胞質顯示橘紅色熒光第十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一DAPIDAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm。第十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一DAPI染色原理：

DAPI為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發(fā)揮標記的作用，可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察細胞標記的效率高(幾乎為100%)，且對活細胞無毒副作用。第十三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一第十四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一2.細胞壁研究

熒光顯微技術在植物細胞學中應用的一個突出方面,是用于鑒定細胞壁成分,研究壁形成和再生,以及壁在植物發(fā)育過程中和環(huán)境影響下性質的變化觀察細胞壁的方法很多,如用專一的染料染色或利用纖維素的偏振光性質等。現(xiàn)在國外常用的方法是熒光增白劑染色,在4QOnm左右的激發(fā)光照射下觀察細胞壁(纖維素)所產生的綠色熒光來判斷細胞壁的有無

第十五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一熒光增白劑染色熒光增白劑和細胞壁成分有強烈親和力,當前常用的熒光增白劑有ST,M2R,VBL.ST開始被用于顯示細菌,放線菌與真菌的細胞壁,在粘菌材料中,它被證明與纖維素和幾丁質有親和力胼胝質是一種以β-1,3鍵結合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，其合成、分解直接關系植物正常的生長代謝過程。第十六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一胼胝質是一種以β-1,3鍵結合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，其合成、分解直接關系植物正常的生長代謝過程。

第十七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一3細胞生活力測定熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養(yǎng)動植物細胞以及植物細胞原生質體的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當FDA進入活細胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的、能產生熒光的物質——熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內，因而使有活力的細胞產生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使FDA分解，而無法產生熒光第十八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一活體染色

vitalstaining

將無毒或毒性較小的某種染料注入動物體內,可被機體內某些組織或細胞所攝取,稱為活體...第十九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一影響熒光的因素1.pH的影響帶有酸性或堿性官能團的大多數芳香族化合物的熒光一般都與溶液PH值有關，例如：在pH=7-12的溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出藍色熒光；而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以離子形式存在，都不會發(fā)出熒光。同時所用酸的種類也影響熒光的強度，例如：奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強。第二十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一2.溫度的影響溫度對熒光強度的影響較敏感。溶液溫度下降時，介質的粘度增大，熒光物質與分子的碰撞也隨之減少，去活化過程也減少，則熒光強度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質與分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強度下降。第二十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一3.熒光強度與溶液濃度的關系

在稀溶液中：F＝KcF為熒光強度K-檢測效率（由儀器決定）c為液體的濃度高濃度時，熒光物質發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關系第二十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期一4猝滅劑

何為猝滅?