免疫分析技術(shù)之ELISA王娟

免疫分析技術(shù)之ELISA王娟第1頁/共104頁ELISA概念酶聯(lián)免疫吸附實驗（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA），是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術(shù)，基礎(chǔ)是：抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。第2頁/共104頁酶免疫測定類型

這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定，簡稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定第3頁/共104頁1.1抗原抗體反應(yīng)

1.1.1可逆性

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。第4頁/共104頁1.1.2特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

第5頁/共104頁1.1.3敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。第6頁/共104頁1.2免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。第7頁/共104頁基本原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。③在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。④由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。第8頁/共104頁2

ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計出各種不同類型的檢測方法。第9頁/共104頁2.1雙抗體夾心法測抗原A.

將抗體吸附于固相表面；B.

加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；C.

加酶標(biāo)抗體；D.加底物。底物的降解量＝抗原量。此法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。第10頁/共104頁2.2雙抗原夾心法測抗體

用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。第11頁/共104頁2.3間接法測抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。A.

將抗原吸附于固相載體表面；B.

加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測定底物的降解量＝抗體量第12頁/共104頁2.4競爭法測抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

第13頁/共104頁2.5競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

第14頁/共104頁2.6捕獲包被法測抗體IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。第15頁/共104頁2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；第16頁/共104頁3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液第17頁/共104頁ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體

聚苯乙烯，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯，聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。第18頁/共104頁3.1.2包被的方式

將抗原或抗體固定的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。第19頁/共104頁不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。第20頁/共104頁天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。3.1.3包被用抗原第21頁/共104頁3.1.4包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。第22頁/共104頁3.1.5包被的條件

pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第23頁/共104頁3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？第24頁/共104頁ELISA的試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物

即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑

1酶的催化活性

2抗體（或抗原）的免疫活性

3含有或少含有游離的抗體（或抗原）

4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性第25頁/共104頁3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體

制備結(jié)合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。第26頁/共104頁3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。第27頁/共104頁酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效.3.2.3結(jié)合物的制備第28頁/共104頁

結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。第29頁/共104頁

酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。3.2.4結(jié)合物的保存第30頁/共104頁

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。3.2.5結(jié)合物的稀釋第31頁/共104頁試劑準(zhǔn)備

C酶的底物第32頁/共104頁3.3酶的底物3.3.1

HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。第33頁/共104頁TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。第34頁/共104頁AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。第35頁/共104頁4對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。第36頁/共104頁參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。第37頁/共104頁5標(biāo)本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。第38頁/共104頁加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马椀?9頁/共104頁保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第40頁/共104頁洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：第41頁/共104頁（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。第42頁/共104頁顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。第43頁/共104頁比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。第44頁/共104頁酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細閱讀說明書。第45頁/共104頁6結(jié)果判斷

6.1定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。第46頁/共104頁A.陽性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。B.標(biāo)本/陰性對照比值：在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。間接法和夾心法第47頁/共104頁（2）競爭法因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。

a.陽性判定值法陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX陽性A≤陽性判定值陰性A＞陽性判定值

b.抑制率法抑制率（%）=（陰性對照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對照陽性抑制率≥50%為陰性＜50%第48頁/共104頁4.7.2定量測定ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。第49頁/共104頁4.ELISA的操作要點嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。第50頁/共104頁第51頁/共104頁免疫分析技術(shù)之液相芯片技術(shù)及應(yīng)用廣東省功能蛋白質(zhì)組重點實驗室王娟第52頁/共104頁liquichip液相芯片系統(tǒng)___

液相芯片系統(tǒng)有機地整和了有色微球（color-codedmicrosphereorbead）、激光技術(shù)、流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號處理器和計算機運算法則，造就了Luminex100無與倫比的檢測特異性和靈敏度。第53頁/共104頁BenefitsApplicationsFutureTechnology第54頁/共104頁PrincipleMostbioassaysconsistoftwoormorebiomoleculesinteracting第55頁/共104頁PrincipleUsingLiquiChip-Technologythesebiologicalinteractionstakeplaceonsmall,microscopicalbeadsthesebeadsarefluorescent(red)第56頁/共104頁PrincipleDetectionandQuantitationofthesebiologicalinteractionsismadebyfluorescentdetectionreagentsBeads球形基質(zhì)Capturemolecule探針分子Analyte待檢測物Reportermolecule報告分子第57頁/共104頁AssaysonUniform

Polystyrene(聚苯乙烯)BeadsDiameter5.6μm第58頁/共104頁TwointernalDyesforBeadClassificationDefinedMixture Dyingin ShrinkinginofbothDyes OrganicSolventAqueousSolvent第59頁/共104頁Two-ColorBead-CodingBasedonxMAPtechnologyByusing10differentlevelsofeachoftwofluorescentdyes,anarrayof100beads,eachwithauniquecolorsignature,iscreated第60頁/共104頁

為了便于探針分子的固定，在球形基質(zhì)的表面進行了一系列的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定

第61頁/共104頁“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell第62頁/共104頁“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell第63頁/共104頁“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell第64頁/共104頁反應(yīng)主要包括3個步驟探針分子的固定將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報告熒光的報告分子與目的分子特異性的結(jié)合，對反應(yīng)進行定量反應(yīng)結(jié)果的檢測第65頁/共104頁LiquiChipWorkstationFlowcytometer-basedtechnologyMeasuresfluorescenceComponents:ReaderMicroplateHandlerFluidModule第66頁/共104頁FlowCytometerbasedAnalysisBeadsarealignedinasinglefilestreambyhydrodynamicfocusingTwolasersareusedforexcitationoffluorescence第67頁/共104頁PrincipleofDetectionTheredlaserisusedtoidentifythebeadcodeThegreenlaserisusedtoidentifythereportersignal第68頁/共104頁

利用這100種球形基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，同時對一個樣本中的100種不同的目的分子進行檢測。

第69頁/共104頁AFHEBGCD第70頁/共104頁Benefits第71頁/共104頁系統(tǒng)的優(yōu)點靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受實驗室已有的實驗方案，使用者可以自行設(shè)計分析方案，也可使用成套試劑盒

通量大，可對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對96個不同樣本進行檢測液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測物的反應(yīng)靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進行檢測操作簡便，耗時短，成本低

第72頁/共104頁第73頁/共104頁第74頁/共104頁4%CV第75頁/共104頁Liquichip和ELISA靈敏度的比較

分別用ELISA和liquichip對硫氧還蛋白進行定量測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線

I：使用liquichip測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線

II、III：使用ELISA測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線第76頁/共104頁ComparedtoELISA:樣本需求量小:ELISA每次實驗均至少需要100～200μl外周血，而采用液相芯片只需50μl血液即可在一支試管中完成所有檢測項目,總體可節(jié)約80%以上的樣本，這對外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有意義;操作流程簡化:由于ELISA工作曲線的置信區(qū)間僅2～3對數(shù)級，因而對于較高濃度的細胞因子的檢測,其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以滿足實驗精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達4～5對數(shù)級，活性范圍可10倍于ELISA,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌步驟;高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率大大高于ELISA固相沉底。第77頁/共104頁Measuringthelevelofmanyhumanormousecytokinesinasinglesample第78頁/共104頁第79頁/共104頁Ready-to-useBroad-RangeKinasekitsformeasuringkinaseactivity

Ser/ThrKinase,TyrKinaseKit

Kinase/PhosphorylatedProtein第80頁/共104頁nowashingstepsfasterhigherthroughputquantitativeassayresultsnohazardousgels/radioactivitySensitivity:higherthanECL/colorimetricassays,comparabletoorbetterthanradioactiveassaysAdvantagescomparedtoWestern

blotprocedures第81頁/共104頁Applications第82頁/共104頁WhentousetheLiquiChipSystem?TheLiquiChipSystemisusedforalargevarietyofproteinassays:ImmunoassaysEnzymeAssaysProtein-proteininteractionAssaysReceptorligandAssaysProteinnucleicacidassays第83頁/共104頁AssayTypesImmunoassaysEnzymeassays(kinase,protease)DNA-hybridizationassays

Interactionassays第84頁/共104頁RealizethePowerofSuspensionArraysAssaysystemthatoffers:multiplexingofassaysuptoafactorof100amix-and-measureprocedures(nowashing)suspensionenzymeassays(kinase,phosphataseandproteaseassays)第85頁/共104頁

A

utoimmune

ASCAHuman

beta-2MicroglobulinHuman

Mouse

CentromereBHuman

ChromatinHuman

ENAProfile4(SSA,SSB,Sm,RNP)Human

ENAProfile5(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70)Human

ENAProfile6(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1)Human

HistoneHuman

HistoneH1Human

HistoneH2AHuman

HistoneH2BHuman

HistoneH3Human

HistoneH4Human

HSP-27pS82General

HSP-27TotalGeneral

HSP-32Human

HSP-65Human

HSP-71Human

HSP-90aHuman

HSP-90bHuman

Jo-1Human

PCNAHuman

Mouse

PR3Human

PR3(cANCA)Mouse

RibosomalPHuman

Mouse

RNPHuman

Mouse

RNP-AHuman

RNP-CHuman

SCFHuman

Mouse

Scl-70Human

Mouse

SerumAmyloidPHuman

SLEProfile8(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1,Ribosome-P,chromatin)Human

SmGeneral

Human

SmithMouse

Human

SSAHuman

Mouse

SSBHuman

Mouse

StreptolysinOHuman

TPOHuman

Mouse

第86頁/共104頁AllergyTestingAlternaria(Mold)Human

BermudaGrassHuman

CatDanderHuman

EggWhiteHuman

MilkHuman

MitePternoyssinusHuman

MountainCedarHuman

ShortRagweedHuman

TimothyGrassHuman

Wheat(food)Human

第87頁/共104頁CancerMarkersalphaFetoproteinHuman

CancerAntigen125Human

CarcinoembryonicAntigenHuman

PSA,FreeHuman

第88頁/共104頁CardiacMarkers

CreatineKinase-MBHuman

Endothelin-1Mouse

PAPHuman

SGOTHuman

Mouse

TIMP-1Human

Mouse

第89頁/共104頁CytokinesBDNFHuman

CREBpS133General

CREBTotalGeneral

DR-5Human

EGFHuman

Mouse

ENA-78Human

EotaxinMouse

Human

FattyAcidBindingProteinHuman

FGF-basicHuman

Mouse

G-CSFHuman

Mouse

GCP-2Mouse

GM-CSFHuman

Mouse

Rat

GRO-KCRat

HGFHuman

Mouse

ICAM-1Human

IFN-alphaHuman

IFN-gammaHuman

Mouse

Rat

IL-10Human

Mouse

Rat

IL-11Mouse

IL-12Human

Mouse

IL-12p40Human

Mouse

IL-12p40/p70Mouse

Rat

IL-12p70Human

Mouse

Rat

IL-13Human

Mouse

IL-15Human

Mouse

IL-16Human

IL-17Human

Mouse

IL-18Rat

IL-1alphaMouse

Human

Rat

IL-1betaHuman

Mouse

Rat

IL-1raHuman

IL-1ra/IL-1F3Human

IL-2Human

Mouse

Rat

IL-3Human

Mouse

IL-4Human

Mouse

Rat

IL-5Human

Mouse

IL-6Human

Mouse

Rat

IL-7Human

Mouse

IL-8Human

IL-9Mouse

IP-10Human

Mouse

JE/MCP-1Mouse

KCMouse

KC/GROaMouse

LIFMouse

LymphotacinHuman

Mouse

M-CSFMouse

MCP-1Human

Mouse

Rat

MCP-1(MCAF)Human

MCP-3Mouse

MCP-5Mouse

MDCHuman

Mouse

MIGHuman

Mouse

MIP-1alphaHuman

Mouse

MIP-1betaHuman

Mouse

MIP-1gammaMouse

MIP-2Mouse

MIP-3betaMouse

OSMMouse

PDGF-BBMouse

RANTESHuman

Mouse

Rb(pT821)Human

Rb(total)Human

RbpSpT249/252Human

Tau(pS214)Human

Tau(pS396)Human

Tau(total)Human

TissueFactorHuman

Mouse

TNF-alphaHuman

Mouse

Rat

TNF-betaHuman

TNF-RIHuman

TNF-RIIHuman

VCAM-1Mouse

VEGFHuman

Mouse

第90頁/共104頁EndocrineAdiponectinHuman

Rat

AmylinMouse

Rat

Human

C-PeptideHuman

CalcitoninHuman

CRFHuman

FGF-9Mouse

GLP-1Human

Mouse

Rat

GlucagonMouse

Rat

Human

GrowthHormoneHuman

Mouse

InsulinHuman

Mouse

Rat

LeptinHuman

Mouse

Rat

Lipoprotein(a)Human

ResistinHuman

Mouse

Rat

T3Human

T4Human

TBGHuman

ThyroglobulinHuman

TSHHuman

第91頁/共104頁GenotypingFlexMAP?General

MitochondrialDNAScreeningGeneral

Tag-It?MutationDetectionKitGeneral

Y-SNPIdentificationGeneral

第92頁/共104頁InfectiousdiseaseAdenovirusHuman

Mouse

BordetellapertussisHuman

CampylobacterjejuniHuman

ChlamydiapneumoniaeHuman

ChlamydiatrachomatisHuman

CholeraToxinHuman

CholeraToxinbHuman

Clostridiumpiliforme(Tyzzer's)Mouse

CytomegalovirusHuman

Mouse

DiphtheriaToxinHuman

EctromeliavirusMouse

EDIM(Epidemicdiarrheaofinfantmice)Mouse

EncephalitozooncuniculiMouse

Epstein-BarrEAHuman

Epstein-BarrNAHuman

Epstein-BarrVCAHuman

HBVCoreHuman

HBVEnvelopeHuman

HBVSurface(Ad)Human

HBVSurface(Ay)Human

HCVCoreHuman

HCVNS3Human

HCVNS4Human

HCVNS5Human

HelicobacterpyloriHuman

HepatitisAHuman

HepatitisDHuman

HIV-1gp41Human

HIV-1p24Human

HPVHuman

HSV-1gDHuman

HSV-1/2Human

HSV-2gGHuman

HTLV-1/2Human

InfluenzaAHuman

InfluenzaAH3N2Human

InfluenzaBHuman

LeishmaniadonovaniHuman

LymediseaseHuman

LymphocyticchoriomeningitisvirusMouse

M.pneumoniaeHuman

M.tuberculosisHuman

MinutevirusMouse

MumpsHuman

MycoplasmapulmonisMouse

Parainfluenza1Human

Parainfluenza2Human