紫外可見分光光度法

關(guān)于紫外可見分光光度法PPT第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2第一節(jié)基本原理一、紫外-可見吸收光譜（UV-VIS光譜）紫外-可見分光光度法起源：價電子能級躍遷由于分子吸收紫外-可見光區(qū)的電磁輻射，分子中價電子（或外層電子）的能級躍遷而產(chǎn)生。紫外光譜—又稱為電子光譜—分子吸收光譜問題1：為何UV-Vis光譜吸收帶都比較寬??第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三3

解答分子吸收紫外可見光時，不僅會引起電子能級的躍遷，振動能級和轉(zhuǎn)動能級同時會發(fā)生躍遷。振動能級的間隔要比電子能級的間隔小很多，轉(zhuǎn)動能級間隔更小。這樣對于某一電子能級的躍遷，由于同時伴隨著振、轉(zhuǎn)能級的躍遷，吸收光子的頻率就不是唯一的了，而是很多非常相近的頻率分布在一個較大的頻率范圍內(nèi)。在儀器的分辨率不是特別高時，這些頻率就看起來是連續(xù)的，從而形成帶狀光譜。

第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三4吸收帶躍遷類型官能團lmaxeR帶n?p*雜原子不飽和基團~300nm<102K帶p?p*共軛雙鍵>200nm>104B帶分子振動轉(zhuǎn)動能極苯環(huán)~256nm~200E帶p?p*苯環(huán)大p鍵E1:180nmE2:200nm4.7′1047000

二、吸收帶問題2：當(dāng)溶劑極性增大時，為何K帶和R帶的間距減小??第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三5

解答：影響吸收帶的因素共軛體系越長，λmax↑→紅移，εmax↑—UV光譜的基本規(guī)律

溶劑極性增大

*的max

紅移n*的max

蘭移溶劑效應(yīng)溶劑極性增大，R帶和K帶間距離降低第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三6體系pH值的影響：例：苯酚

E2帶：λmax=211nm(ε6200)λmax=235nm(ε9400)B帶：λmax=270nm(ε1450)λmax=287nm(ε2600)pH值增大（加堿）→E2、B帶紅移，ε增大pH值降低（加酸）→E2、B帶藍移，ε減小例：苯胺

E2帶：λmax=230nm(ε8600)λmax=203nm(ε7500)B帶：λmax=280nm(ε1475)λmax=254nm(ε160)pH值降低（加酸）→E2、B帶藍移，ε減pH值增大（加堿）→E2、B帶紅移，ε增大第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三7儀器校正

1、波長校正苯的吸收峰校正波長（紫外光區(qū)）。在25ml容量瓶內(nèi)，滴入一滴苯(A.R.)，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻后，以無水乙醇為空白，在200～280nm間用lcm石英池測定吸收度。如下：

229.2233.5238.9243.2248.5254.5260.6268.4精度(nm)±3.0………±3.0±3.5重現(xiàn)性(nm)±0.15………±0.15±0.20

2、吸收池的校正：配對（兩個吸收池T差值ΔT＜0.5%）第二節(jié)紫外可見分光光度計第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三84、吸收度的準(zhǔn)確度校正精密稱取在120℃干燥至恒重的重鉻酸鉀基準(zhǔn)試劑0.2g(稱準(zhǔn)至0.lmg)，置500ml容量瓶中，用0.02mol/LH2SO4液溶解，并稀釋至500ml，搖勻（貯備液）。取4m1貯備液稀釋稀釋25ml容量瓶中(64mg/L），在規(guī)定的波長處測定并計算其吸光系數(shù)，并與規(guī)定的吸光系數(shù)比較，應(yīng)符合下表中規(guī)定。

波長（nm）235（最小）257（最大）313（最?。?50（最大）吸光系數(shù)

的規(guī)定值

124.5144.048.62106.6吸光系數(shù)

的許可范圍123.0~125.0142.8~146.247.0~50.3105.6~1083、雜散光校正：

1.2%KCl溶液，H2O空白，200nm；T1.0%試劑濃度%（g/ml）測定用波長（nm）透光率（%）氯化鉀1.20200＜1.0碘化鈉1.00220＜0.8亞硝酸鈉5.00340＜0.8第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三5.吸收值精度和儀器線性范圍精密稱取在120℃干燥至恒重的重鉻酸鉀基準(zhǔn)試劑0.2g(稱準(zhǔn)至0.lmg)，置500ml容量瓶中，用0.02mol/LH2SO4液溶解，并稀釋至500ml，搖勻（貯備液）。用刻度吸管精密量取上述重鉻酸鉀溶液1ml、2ml、3ml、…、10ml分別置于25ml容量瓶中，均用0.02mol/L的H2SO4稀釋至刻度，搖勻。(2)測定：選好配對的lcm石英比色池，以0.02mol/L的H2SO4為空白，選擇S值，掃描4m1貯備液制成的稀釋液在230～360nm間的UV光譜。(3)

將以上10種濃度作A-C曲線，求回歸直線方程。(4)計算：根據(jù)稱樣及稀釋度，計算出各個的吸光系數(shù)，在直角坐標(biāo)紙上，以各吸光度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光系數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出吸光系數(shù)-吸光度曲線。一般來說，儀器測出的吸光系數(shù)，在吸光度過小時，常偏高，過大時，常偏低，其間有一段平坦區(qū)，在這區(qū)間測出的吸光度計算出的吸光系數(shù)是一個常數(shù)，它與平均值的偏差不超過±0.2％的一段，為這臺儀器的線性范圍或最佳工作范圍。(1)溶液配制方法：第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三10第三節(jié)定性和定量分析一、定性分析二、定量分析定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測定單組分的定量方法多組分的定量方法第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三問題3下列關(guān)于紫外光譜的敘述正確的是——A.兩個化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同。B.紫外光譜完全相同的兩個化合物，一定是同一化合物。C.兩個化合物相同，其紫外光譜不一定相同。D.紫外光譜完全相同的兩個化合物，不一定是同一化合物。

E.同一種化合物只要是在溶液中測定，則其紫外光譜總

是相同的。C相同物質(zhì)的吸收光譜的特征（λmax、λmin、λsh等）相同，當(dāng)濃度及測定條件相同時，吸收光譜才相同第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三12二、定量分析（一）單組分的定量方法1、吸光系數(shù)法2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法3、對照法：外標(biāo)一點法組分λmax＞溶劑的截止波長測定波長選吸收最大，干擾最小第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三13拓展：導(dǎo)數(shù)光譜在中藥分析中的應(yīng)用實例圖1陳香白露片中橙皮甙的吸收光譜圖2陳香白露片中橙皮甙的導(dǎo)數(shù)光譜1.橙皮甙2.甘草浸膏1.橙皮甙2.甘草浸膏3.其余各組分+陳皮中的干擾組分3.其余各組分+陳皮中的干擾組分

△λ=10nm中間波長λm1=274nm,λm2=254.5nmλm==274nm第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（一）旋光光譜(ORD)

有機化學(xué)知識回顧：

具有手性的有機分子和它的鏡像是對稱的但不能互相重疊。當(dāng)平面偏振光通過它時，偏振面便發(fā)生旋轉(zhuǎn)，即所謂該物質(zhì)具有“旋光性”。我們將偏振面所旋轉(zhuǎn)的角度稱之為旋光度，可用旋轉(zhuǎn)檢偏鏡進行測定。從觀察者的角度看，當(dāng)檢偏鏡順時針方向旋轉(zhuǎn)時，樣品稱右旋(+)物質(zhì)，逆時針方向旋轉(zhuǎn)時稱左旋(一)物質(zhì)其他新型光度分析法手性化合物旋光鏡示意圖

第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

平面偏振光(即線偏振光)可看成是以相同的傳播速度前進的左、右兩個圓偏振光的矢量和。介質(zhì)有對稱結(jié)構(gòu)時，左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的矢量和在同一個平面，是忽長忽短周期性變化的一條線。旋光現(xiàn)象圖8-2平面偏振光和圓偏振光的關(guān)系

(a)平面偏振光；(b)左、右圓偏振光；(c)平面偏振光由相等的左、右圓偏振光合成第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三介質(zhì)為有不對稱結(jié)構(gòu)的晶體或手性化合物的溶液(旋光性物質(zhì))，如冰晶石或葡萄糖水溶液，左旋圓和右旋圓偏振光在介質(zhì)中的傳播速度不同(即折射率不同）使其矢量和偏離原來的偏振面，偏離程度隨光程增大而增大—旋光現(xiàn)象圖8-3平面偏振光在不對稱介質(zhì)中傳播時發(fā)生旋轉(zhuǎn)以不同波長的平面偏振光來測量化合物的比旋光度[α]λ并以[α]λ

或有關(guān)量作縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)——旋光光譜[α]λ=(α實

/cl)×100

常以摩爾旋光度[φ]λ代替[α]λ

[φ]λ=[α]λ

/100旋光光譜（ORD）第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三1）無發(fā)色團的飽和化合物旋光值為負(fù)值的化合物，ORD譜線從紫外到可見區(qū)呈單調(diào)上升；旋光值為正的化合物是單調(diào)下降。兩種情況下都趨向和逼近0線，但不與0線相交，即譜線只是在一個相內(nèi)延伸，沒有峰也沒有谷——正常的或平坦的旋光譜線紫外和可見區(qū)的ORD圖8-4(+)和(-)丁醇-2的ORD譜線第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2）發(fā)色團(如羰基)

R帶：270nm。ORD曲線在此處越過零點，進入另一個相區(qū)。形成的一個峰和一個谷組成的ORD譜線—Cotton效應(yīng)譜線正的Cotton效應(yīng)：當(dāng)波長由長波一端向短波一端移動時，

ORD譜線由峰向谷變化負(fù)的Cotton效應(yīng)：ORD譜線由谷向峰變化ORD譜線與零線相交點的波長稱為λK圖8-5樟腦酮的ORD譜線第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三旋光光度計第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.圓二色光譜(CD)

2.1原理旋光性有機分子對組成平面偏振光的左旋圓偏光和右旋圓偏光的摩爾吸光系數(shù)是不同的，即εL≠εR，——圓二色性。摩爾吸光系數(shù)之差△ε

=εL-εR，是隨入射偏振光的波長變化而變化的。以△ε或有關(guān)量為縱坐標(biāo)，波長(紫外可見光區(qū))為橫坐標(biāo)，得到的圖譜就叫圓二色光譜(CD)。圓二色性常用摩爾橢圓度[θ]來度量，它與摩爾吸光系數(shù)差之間的換算關(guān)系式為通常近似為第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.圓二色光譜(CD)

2.2儀器圓二色光譜計示意圖

第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用近年來人們發(fā)現(xiàn)瘋牛病、克-雅氏病和震顫病等神經(jīng)退行性疾病是由Prion病蛋白所致，而構(gòu)象變化在Prion病蛋白的致病因素中起著至關(guān)重要的作用。因此，蛋白質(zhì)的構(gòu)象對其生理功能的研究具有巨大意義。目前確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法是X-射線晶體衍射，但對結(jié)構(gòu)復(fù)雜柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來說，得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難，二維、多維核磁共振技術(shù)能測出溶液狀態(tài)下較小蛋白質(zhì)的構(gòu)象，可是對分子量較大的蛋白質(zhì)的計算處理非常復(fù)雜，相比之下，圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準(zhǔn)確的方法。

1969年Greenfield最早用CD光譜數(shù)據(jù)估計了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。近十幾年以來，研究者發(fā)現(xiàn)，近紫外CD（250~320nm）作為一種靈敏的光譜探針，可反映蛋白質(zhì)中芳香氨基酸殘基、二硫鍵微環(huán)境的變化；遠紫外區(qū)CD（178~250nm）反映肽鍵的圓二色性。第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用

2.3.1蛋白質(zhì)的圓二色性在蛋白質(zhì)或多肽中，主要的光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵，芳香氨基酸殘基及二硫橋鍵。當(dāng)平面圓偏振光通過這些光活性的生色基團時，光活性中心對平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生吸收差值。由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性。圓二色性的大小也可用摩爾橢圓度[θ]來度量近似為第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用

2.3.2蛋白質(zhì)的遠UVCD—二級結(jié)構(gòu)

α-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶,在222和208nm處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征肩峰譜帶;β-折疊的CD譜在216nm有一負(fù)譜帶,在185~200nm有一正譜帶;β-轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶。因此，根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息。

第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.2.3蛋白質(zhì)的遠UVCD—三級結(jié)構(gòu)

全α型α+β型和α/β型蛋白在222nm和208nm都表現(xiàn)出明顯的負(fù)峰，而在190~195nm內(nèi)都有正峰。全α型蛋白的正、負(fù)CD信號交叉在低于172nm波長處，若交叉發(fā)生在更高的波長位置，則很可能是含有β型結(jié)構(gòu)。據(jù)此可區(qū)別全α型α+β型和α/β。圖2b中α型的溶菌酶和核糖核酸酶A及圖2c中α/β型的丙糖磷酸異構(gòu)酶、黃素氧化還原酶、枯草桿菌蛋白酶BPN’的正、負(fù)CD信號交叉都發(fā)生在高于172nm波長處。比較圖2b和2c的差別可發(fā)現(xiàn)，222nm和208nm兩處的CD數(shù)據(jù)能區(qū)分α+β型和α/β兩種不同類型的蛋白質(zhì)。α+β類型的蛋白質(zhì)208nm比222nm的CD值要大，而α/β型蛋白的CD譜特征正好相反。而全β型蛋白缺乏象α-螺旋那樣明顯的CD特征。圖2d和2e中前血清蛋白和α-糜蛋白酶等全β型結(jié)構(gòu)的蛋白表現(xiàn)出不同的CD譜峰特征。第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三1）紫外可見區(qū)域，用不同波長的左、右旋圓偏振光測量CD和ORD的主要目的是研究有機化合物的構(gòu)型或構(gòu)象。在這方面，ORD和CD所提供的信息是等價的。2）200～800nm內(nèi)無特征吸收，ORD呈單調(diào)平滑曲線，CD近于水平直線。3）200～800nm內(nèi)有特征吸收，則ORD和CD都呈Cotton效應(yīng)4)當(dāng)ORD呈正的Cotton效應(yīng)時，相應(yīng)的CD也呈正的Cotton效應(yīng)5)理想情況下，UV吸收峰λmax、CD的△ε絕對值最大對應(yīng)波長(呈峰或谷處)及ORD的λK三者應(yīng)相等6)cotton效應(yīng)的正、負(fù)與化合物中靠近生色團的手性中心的構(gòu)型有密切的聯(lián)系，在一定條件下可將不對稱分子中某生色團吸收峰的Cotton效應(yīng)的正、負(fù)號與該生色團附近的手性中心的構(gòu)型聯(lián)系起來。旋光光譜、圓二色光譜、紫外光譜之間的關(guān)系第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三圖8-7ORD、CD與UV譜線的關(guān)系圖8-8旋光譜(上)和圓二色光譜(下)與右旋發(fā)色團(a)和左旋發(fā)色團(b)對應(yīng)關(guān)系第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三圖8-91R-(+)-2-苯駢降冰片的CD和UV譜正的CD譜相應(yīng)于R帶第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三UV光譜的應(yīng)用—DNA與藥物相互作用研究進展

DNA分子在260nm附近處有強吸收，可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對二者相互作用模式進行判斷。(1)如導(dǎo)致分子的構(gòu)象變化對于UV來說，則DNA的吸收光譜產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象；如破壞了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，則產(chǎn)生增色效應(yīng)。(2)金屬配合物等分子與DNA發(fā)生嵌插作用，則該分子的吸收光譜峰出現(xiàn)減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象；如該分子與DNA發(fā)生靜電作用或溝槽作用,則光譜峰出現(xiàn)較小的紅移，且減色效應(yīng)不明顯

。1、UV-VIS法2、圓二色光譜（CD）法圓二色光譜(CD)是以高頻變換的左旋或右旋偏振光為入射光，根據(jù)結(jié)合了小分子和沒有結(jié)合小分子的DNA在260nm處的吸收的改變得到有關(guān)其結(jié)構(gòu)的信息或?qū)σ恍┍旧頉]有CD信號，但在與DNA結(jié)合后能產(chǎn)生誘導(dǎo)CD的分子，也可得到其結(jié)構(gòu)的信息。第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

甲萘威(carbaryl)雖然本身無明顯的致癌作用,但是其與亞硝酸鹽聯(lián)合作用時就具有致癌、致畸及誘變作用。通過紫外光譜法研究了甲萘威與DNA的相互作用.結(jié)果顯示,在甲萘威的作用下,DNA的吸收光譜出現(xiàn)增色與紅移現(xiàn)象。實驗結(jié)果支持甲萘威能以嵌插方式與DNA形成加合物。

應(yīng)用實例1：光譜法研究甲萘威與DNA的相互作用第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

1.紫外可見吸收光譜

圖1為模擬生理條件下，大黃酸UV吸收光譜及大黃酸一BSA體系的UV吸收差譜。由圖可見，大黃酸220nm處吸收峰強度有規(guī)律地降低并且峰位發(fā)生紅移。說明大黃酸與BSA之間有顯著的相互作用，同時也說明它們的相互作用使該共軛體系的能級發(fā)生了明顯的變化。應(yīng)用實例2：光譜及電化學(xué)方法研究大黃酸與牛血清白蛋白的相互作用—光譜學(xué)與光譜分析,2011,31(9):2446-2449第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.圓二色譜法

為研究大黃酸與BSA作用過程中BSA二級構(gòu)象的變化，對比測試了BSA及大黃酸-BSA體系的圓二色譜。由圖5看出應(yīng)用實例2：光譜及電化學(xué)方法研究大黃酸與牛血清白蛋白的相互作用b和C的CD波譜相對于a有明顯的紅移現(xiàn)象，表明大黃酸與BSA結(jié)合改變了BSA空間構(gòu)象。第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三概念：在溶液中加入表面活性劑，不僅增溶，更重要的是增大傳統(tǒng)分光光度法的靈敏度。特點：摩爾吸光系數(shù)增大，峰紅移高配位、多元絡(luò)合物，分子截面積a大ε＝0.87×1020pa光吸收強度與整個光譜帶的積分吸收強度有關(guān)εmax與截面積有關(guān)，也受半峰頻寬的約束（一）膠束增溶分光光度法第四節(jié)拓展：其他新型光度分析法第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三能顯著降低水的表面張力的物質(zhì)為表面活性劑SurfaceActiveMaterial表面活性劑-概念非表面活性劑無機鹽，蔗糖，甘露醇非表面活性劑醇，醛，酸，酯表面活性劑肥皂濃度在0.2%時表面張力降至40％分子結(jié)構(gòu)：兩親分子親水基hydrophilicgroup憎水基hydrophobicgroup第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三離子與非離子型表面活性劑-分類陽離子型伯仲叔季胺鹽，烷基吡啶陰離子型羧、磺酸鹽，硫、磷酸酯鹽兩性型氨基酸、甜菜堿型非離子型聚氧乙烯、多元醇型第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三表面活性劑-C.M.C.膠束的形成C.M.C.CriticalMicelleConcentration形成膠束所必需的最低濃度膠束增溶作用形成膠束后，難溶物水中溶解度顯著增大。微環(huán)境不同含不溶性脂肪醇的烷基硫酸鹽溶液稀釋，變渾濁擬均相萃取第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三埃鉻菁R＋Be2＋

(pH6.9)C.M.C.以上的Zeph存在，增敏Zeph氯化十四烷基二甲基芐基銨埃鉻菁R膠束增溶分光光度法-實例第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三膠束增溶分光光度法-實例有Zeph595nm最大Be:ECR=1:1無Zeph522nm最大Be:ECR=1:2第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三膠束增溶分光光度法-非離子型表面活性劑的增溶/增穩(wěn)/增敏實例金屬－雙硫腙體系傳統(tǒng)：用CHCl3或CCl4萃取TritonX-100增溶水相直接測定銅鋅等對-(1,1,3,3,-四甲基丁基)-苯基醚Fe(III)－SCN體系分級絡(luò)合，還原退色，10m退10％加TritonX-100靈敏度提高1倍，12h穩(wěn)定第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法優(yōu)點：分析速度快、準(zhǔn)確度和精密度高、節(jié)省試劑和樣品、可與各種檢測技術(shù)、分離技術(shù)結(jié)合。

廣泛應(yīng)用于快速分析、過程分析及在線分析。第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

2.2.第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

2.第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三

2.第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法流動注射分析方法的發(fā)展1.1連續(xù)流動分析技術(shù)連續(xù)流動分析技術(shù)(continuousflowanalysis，CFA)是基于在管道中將連續(xù)流動的試樣溶液用空氣按一定的間隔規(guī)則地隔開，然后按順序和比例混入試劑溶液，在通過混合圈的過程中完成反應(yīng)，除去氣泡后，進入檢測器。這種技術(shù)采用空氣間隔能有效地防止各段試樣間的相互混合，因此它曾在自動分析領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，但氣泡的存在會帶來許多問題。第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法流動注射分析方法的發(fā)展1.2流動注射分析技術(shù)

流動注射分析技術(shù)(flowinjeetionanalysis，F(xiàn)IA)是在連續(xù)流動分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它是一種在沒有氣泡間隔的條件下進行分析的方法。傳統(tǒng)的流動注射分析系統(tǒng)是由多通道蠕動泵、注入閥、反應(yīng)管、檢測器(如分光光度計)及記錄儀組成。根據(jù)峰形信號與被測物濃度具有的相關(guān)性，利用峰面積或峰高可對被測物質(zhì)進行定量分析。第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法流動注射分析方法的發(fā)展1.3順序注射分析技術(shù)

1990年，RUZICKA和MARSHALL在流動注射分析的基礎(chǔ)上發(fā)展了一個流動注射分析的新分支—順序注射分析(sequentialinjectionanalysis，SIA)。順序注射分析系統(tǒng)的核心部分是多通道選擇閥，此閥的各個通道分別與檢測器、樣品、試劑等通道相連，通過泵的作用，順序從不同的通道吸入一定體積的區(qū)帶于泵與閥之間的儲存管中，在此過程中，試劑與試樣由于徑向擴散和軸向?qū)α髯饔没旌?，一定時間后，將其推至檢測器測定。順序注射分析的突出優(yōu)點在于，它可以用同一裝置完成不同項目的分析而無需改變流路設(shè)置。第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法流動注射分析方法的發(fā)展1.3流動注射一可更新表面技術(shù)

流動注射一可更新表面技術(shù)(flowinjectionrenewablesurfaceteehnique，F(xiàn)I-RST)或微珠注射技術(shù)(beadiniection，BI)是流動注射微量分析的第3代技術(shù)。同樣具有多通道選擇閥，只是用微珠作為試劑的載體，試樣與試劑在微珠表面反應(yīng)并實時記錄，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將微珠自動排廢。FI-RST以微珠作為微載體進行溶液處理，自動表面更新后操作，消除了順序注射分析中出現(xiàn)的分析過程中混合試劑之間的相互影響，而且也提高了分析的靈敏度。第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法流動注射分析方法的發(fā)展1.4微全分析系統(tǒng)微全分析系統(tǒng)(micrototalanalysissystems)概念的提出，特別是微流控芯片的發(fā)展，使流動注射分析系統(tǒng)走向微型化。它采用微加工方法在平板上制作出微米級結(jié)構(gòu)，由計算機控制試樣和試劑在這些微結(jié)構(gòu)中的流動、分散、混合及反應(yīng)過程，是目前集成程度和自動化程度最高的流動注射分析系統(tǒng)。已在環(huán)境分析、生命科學(xué)及食品分析等領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)越性。第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法

2.流動注射分析與其他分析方法的聯(lián)用技術(shù)可與分光光度法、原子光譜法、電化學(xué)分析法、發(fā)光分析法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(1CP-AES）、生物傳感器、毛細(xì)管電泳、免疫分析法等技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)成完整的分析系統(tǒng)。流動注射-分光光度法(flowinjection-spectro-photometry，F(xiàn)I-S)是應(yīng)用最普遍的一種聯(lián)用技術(shù)。該方法簡便，價格低廉，可以方便地與信號處理系統(tǒng)連接。廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、水質(zhì)重金屬檢測、食品安全監(jiān)測、藥物分析等領(lǐng)域。第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法

3.流動注射分光光度法在藥物分析中的應(yīng)用

流動注射可分為正相流動注射分析(FIA)和反向流動注射分析(r-FIA)，一般的FIA是指正相流動注射，即將試樣注入閥內(nèi)與流動的試劑混合的測定方法。而r-FIA是將試樣與試劑的位置對調(diào)，靈敏度高于FIA，而且節(jié)省試劑，常用于流動注射分光光度法中。例：2007年，VanessaGKAlmeida等采用了r-FIA紫外-可見分光光度法測定抗利什曼蟲的中銻的含量。靈敏度高，其檢測限可達29ng·mL，檢測速度達到63次每小時。MarcosGrtinhut4等建立了r-FIA紫外-可見分光光度法測定了尿樣中酚類化合物的量，檢測限為7.7mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9％。Kleszczewski等采用流動注射-分光光度法利用維生素C具有還原性的性質(zhì)測定人血清中維生素c，分析速度快、操作簡單、靈敏度高，節(jié)約試劑等。Corominas等建立了FIA紫外-可見分光光度法測定藥物制劑中的青霉胺、異丙嗪和甲哌氟丙嗪，分析速度快(70個每小時)。第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（二）流動注射分光光度法

4.流動注射分光光度法在藥物分析中的發(fā)展FIA紫外一可見分光光度法與各種在線分離富集、轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，如微波、多流路切換技術(shù)、離子交換柱、動力學(xué)分析技術(shù)等，不僅可以進行多組分的測定，而且可以進行價態(tài)分析，提高分析的靈敏度和選擇性。

微波流動注射技術(shù)解決了慢反應(yīng)過程的測定問題，微波場能夠強烈加快金屬離子的反應(yīng)速度，由于微波對各種化學(xué)反應(yīng)速度的影響不同，因此可提高方法的選擇性和檢測的快速性，便于控制和檢測。HuaiwenWang建立了測定微量釕的微波流動注射催化分光光度法，測定出釕的總量。因此將微波技術(shù)與FIA相結(jié)合（BIS—FI）建立測定微量貴重金屬離子的微波FIA新體系具有重要意義。MJRuedasRama等采用了BIS—FIA同時測定異丙嗪和三氟拉唑，此法利用三價鐵能將酚噻嗪類藥物氧化，再通過傳感器信號的變化求出酚噻嗪類藥物的含量，此分析方法靈敏度較高，分析速度快。第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。1.定義

酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)又稱光度酶聯(lián)免疫法，采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，對受檢物質(zhì)進行定性或定量分析的一種檢測方法。優(yōu)勢：靈敏度高、特異性好、檢測速度快、檢測成本（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2.特點

2.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)是一種可逆的動態(tài)平衡Ag+Ab≒Ag·Ab2.2高靈敏性由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的靈敏度。2.3特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。因此，在很多時候，測定某一特定的物質(zhì)不需分離待測物。（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三3.測定原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。③用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。④加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行定性或定量分析。

三種必要的試劑①固相的抗原或抗體②酶標(biāo)記的抗原或抗體③酶作用的底物（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三3.特點

2.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)是一種可逆的動態(tài)平衡Ag+Ab≒Ag·Ab3.2特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。因此，在很多時候，測定某一特定的物質(zhì)不需分離待測物。

3.3最適比例只有當(dāng)抗原抗體的濃度比例是當(dāng)時，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。以沉淀反應(yīng)為例（Ab量固定，Ag量遞增）（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三（三）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）4.酶和底物第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三5.測定方法

1）雙