DNA復制基礎(chǔ)知識演示文稿

DNA復制基礎(chǔ)知識演示文稿當前1頁，總共70頁。優(yōu)選DNA復制基礎(chǔ)知識Ppt當前2頁，總共70頁。第四章DNA復制

DNAReplication1引言---基因組復制與細胞分裂的關(guān)系2復制子3DNA復制的幾種形式4DNA聚合酶5原核生物DNA復制的基本過程6真核生物DNA復制7DNA復制的調(diào)控8小結(jié)當前3頁，總共70頁。重點內(nèi)容：

①幾個重要概念：DNA的復制、復制子、復制眼、復制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留復制、DNA的半不連續(xù)復制、DNA的先導鏈、DNA的后隨鏈、岡崎片段；②不同生物基因組復制子數(shù)目；③線性DNA復制末端問題的提出及解決方案；④θ-復制、滾環(huán)復制及D-環(huán)復制的機制；⑤大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質(zhì)比較，DNA聚合酶Ⅰ與缺口平移法制備探針；⑥D(zhuǎn)NA復制的起始、延伸及終止。了解內(nèi)容：

①基因組復制與細胞分裂的關(guān)系；②復制叉移動方向的確定；真核生物DNA聚合酶的種類及各自的功能；③DNA復制的調(diào)控。

當前4頁，總共70頁。1引言---基因組復制與細胞分裂的關(guān)系

細胞在每次分裂的過程中，整個基因組都必須精確地復制一次。如何保證這一點？兩個原則

(1)DNA復制的啟動決定了細胞的進一步分裂;(2)復制過程完成前，細胞是不會發(fā)生分裂的。當前5頁，總共70頁。2復制子(replicon)2.1復制子的定義2.2不同生物復制子的數(shù)目2.3復制眼概念2.4復制叉概念及其移動方向的實驗確定2.5復制的模式---起點、方向和速度當前6頁，總共70頁。2.1復制子的定義DNA中發(fā)生一次復制的單位稱為復制子(replicon)。復制子是根據(jù)它含有復制所需的控制元件來定義的，在復制啟動位點具起始點（origin)，在復制終止位點具終點（terminus)。起始點僅作用于所在復制子。

注：在每個細胞周期中，每個復制子發(fā)生一次復制，且只發(fā)生一次。當前7頁，總共70頁。質(zhì)粒一般是一個自主環(huán)狀的DNA基因組，構(gòu)成一個獨立復制子；原核生物基因組中一般只含一個復制子，在唯一的起始點啟動就會引起整個基因組復制；真核生物基因組含多個復制子（一般40-100kb/個）。

2.2不同生物復制子的數(shù)目當前8頁，總共70頁。2.3復制眼概念

復制眼：在一個長的未復制區(qū)域內(nèi)DNA已經(jīng)復制的區(qū)域當前9頁，總共70頁。Replicationeye當前10頁，總共70頁。復制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復制能進行的部位。2.4復制叉的概念及其移動方向的確定當前11頁，總共70頁。復制叉移動方向的確定放射性自顯影法：對于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標記復制的移動。如果一個脈沖比另一個脈沖強，我們可以用相對的標記強度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復制：在復制眼的一端，一種類型的標記后緊跟著另一種標記；雙向復制：在復制眼的兩端產(chǎn)生一種（對稱的）模式。在真核生物中普遍存在。當前12頁，總共70頁。2.5復制的模式---起點、方向和速度單起點、單方向多起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向當前13頁，總共70頁。3DNA復制的幾種形式3.1線性DNA雙鏈的復制3.2環(huán)狀DNA雙鏈的復制當前14頁，總共70頁。3.1線性DNA雙鏈的復制3.1.1線性DNA復制的具體表現(xiàn)3.1.2線性DNA復制時末端問題的提出3.1.3線性DNA復制時末端問題的解決方案當前15頁，總共70頁。3.1.1線性DNA復制的具體表現(xiàn)當前16頁，總共70頁。

3.1.2線性DNA復制時末端問題的提出

所有已知的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5`端向3`端移動，新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是5`→3`；而對于DNA的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)DNA復制時，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5`端如何起始呢？這就提出了線性DNA末端復制的問題。當前17頁，總共70頁。當前18頁，總共70頁。復制能在新合成鏈的3`端結(jié)束，它如何在5`端啟動呢？當前19頁，總共70頁。

3.1.3線性DNA復制時末端問題的解決方案(1）通過將線性復制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如λ噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復制子）；(2）某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5`端堿基共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3）DNA可形成特殊的結(jié)構(gòu)，如在末端形成發(fā)夾。使分子沒有游離末端。草履蟲（Paramecium）的線性線粒體DNA的復制中就形成了一種交聯(lián)；(4）末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復制）；當前20頁，總共70頁。（1）通過將線性復制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子當前21頁，總共70頁。TherollingcirclereplicatesDNAPhageλ當前22頁，總共70頁。Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.當前23頁，總共70頁。當前24頁，總共70頁。Adenovirusterminalproteinbindstothe5`endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.（2）某種蛋白質(zhì)介入而在真正的末端啟動復制當前25頁，總共70頁。AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.（3）DNA末端形成特殊結(jié)構(gòu)當前26頁，總共70頁。AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.（4）末端長度可變當前27頁，總共70頁。AloopformsattheendofchromosomalDNA.當前28頁，總共70頁。The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.當前29頁，總共70頁。Watchingflash當前30頁，總共70頁。3.2環(huán)狀DNA的復制3.2.1θ-復制3.2.2滾環(huán)復制3.2.3D-環(huán)復制當前31頁，總共70頁。3.2.1θ-復制

replicationbyθ-structure當前32頁，總共70頁。3.2.2滾環(huán)復制replicationbyrollingcyclesstructureφX174噬菌體由一個單鏈環(huán)狀DNA組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補鏈稱為負（一）鏈。雙鏈體的復制以滾環(huán)復制方式進行。當前33頁，總共70頁。TheAproteiniscis-actingPhageφX174Thereplicationbyrollingcyclestructure當前34頁，總共70頁。3.2.3D-環(huán)復制Replicationbydisplacementloopstructure當前35頁，總共70頁。D-環(huán)復制（Replicationbydisplacementloopstructure)當前36頁，總共70頁。4DNA聚合酶4.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)當前37頁，總共70頁。4.1大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能SOS修復當前38頁，總共70頁。性質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生鏈的合成--+生物學活性10.0515生物學功能切除引物修復DNA修復DNA復制4.1.1大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的性質(zhì)比較當前39頁，總共70頁。（1）DNA聚合酶I

103kDa的單鏈多肽，可以被蛋白酶切成兩段，C端的2/3包括聚合酶活性位點；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10個堿基）。（2）利用DNA聚合酶I進行缺口平移法制備探針的基本原理4.1.2DNA聚合酶I與缺口平移法制備探針當前40頁，總共70頁。Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNaseⅠ當前41頁，總共70頁。4.2真核生物DNA聚合酶的種類及其功能當前42頁，總共70頁。當前43頁，總共70頁。真核生物由不同DNA聚合酶

分別負責起始和延伸三種細胞核DNA復制酶具有不同的功能:DNApolymeraseα起始新鏈合成DNApolymeraseδ延伸先導鏈DNApolymeraseε可能與后隨鏈合成有關(guān)，也可能具有其他功能當前44頁，總共70頁。4.3DNA聚合酶所具有的共同結(jié)構(gòu)許多DNA聚合酶有一個由三個結(jié)構(gòu)域組成的大裂隙，類似于手形。當前45頁，總共70頁。ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.當前46頁，總共70頁。5

原核生物DNA復制的基本過程5.1DNA復制的起始5.2DNA合成鏈的延伸5.3DNA復制的終止當前47頁，總共70頁。5.1.1單鏈DNA的產(chǎn)生5.1.23`-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生5.1.3復制復合體的形成

5.1DNA復制的起始當前48頁，總共70頁。5.1.1單鏈DNA的產(chǎn)生解旋酶(helicase):

使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；當前49頁，總共70頁。拓撲異構(gòu)酶（DNATopisomerase

）拓撲異構(gòu)酶的種類分為Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓撲構(gòu)酶Ⅰ：

MW=100kD，單肽鏈，含3~4個Zn。作用是暫時切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。當前50頁，總共70頁。原核拓撲構(gòu)酶Ⅰ作用機制：①酶與DNA結(jié)合使雙鏈解旋；②使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結(jié)合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；③酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；④酶從DNA上脫落，兩條鏈復原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。當前51頁，總共70頁。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負超螺旋，每次改變兩個連接數(shù)。當前52頁，總共70頁。ReplicationmachineryreplicationPositivesupercoilBreakDNATopoisomeraseIIpassDNAthroughthebreaknegativesupercoil當前53頁，總共70頁。單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein):單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)φX174噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復制起始點，噬菌體A蛋白使病毒（+）鏈產(chǎn)生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。SSB包繞單鏈形成穩(wěn)定的單鏈形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA當前54頁，總共70頁。5.1.23`-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生當前55頁，總共70頁。多種方法可以產(chǎn)生3`-OH末端1)3)2)當前56頁，總共70頁。起始需要解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和引發(fā)酶5.1.3復制復合體的形成當前57頁，總共70頁。5.2DNA合成鏈的延伸5.2.1半保留復制合成兩條新的DNA鏈5.2.2DNA的合成是半不連續(xù)的5.2.3連接酶將岡崎片段連接在一起5.2.4前導鏈和后隨鏈的協(xié)調(diào)合成5.2.5DNA復制忠實性的控制

當前58頁，總共70頁。(1)半保留復制的概念

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制(semiconsertivereplication)。5.2.1半保留復制合成兩條新的DNA鏈當前59頁，總共70頁。(2)半保留復制實驗證據(jù)（Meselson-Stahl)

1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示蹤標記加密度梯度離心技術(shù)實驗,該實驗跟蹤了生長了三代的大腸桿菌，證明了DNA是采取半保留的方式進行復制。[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]當前60頁，總共70頁。5.2.2DNA的合成是半不連續(xù)的

（semidiscontinuousreplication)DNA復制在合成先導鏈（leadingstrand)時是連續(xù)的；而在合成后隨鏈(laggingstrand)時是先形成小片段（Okazakifragment

），隨后再將它們連接而成大片段。因后隨鏈是不連續(xù)合成的而先導鏈是連續(xù)合成的，所以我們稱之為半不連續(xù)復制（semidiscontinuousreplicati