實驗五細菌的革蘭氏染色與細菌

實驗五細菌的革蘭氏染色與細菌第1頁/共8頁實驗五、細菌的革蘭氏染色與細菌的芽孢染色第2頁/共8頁一、實驗目的及內容目的：1、復習革蘭氏染色法的原理

2、初步掌握細菌的涂片方法及革蘭氏染色法的步驟

3、了解細菌的芽孢染色的原理，掌握芽孢染色方法內容：1、制作細菌的染色裝片（復習簡單染色的方法）

2、通過革蘭氏染色，確定蘇云金芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為革蘭氏陰性還是陽性細菌

3、細菌的芽孢染色第3頁/共8頁二、實驗原理1、革蘭氏染色原理：革蘭氏染色法是將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性（G＋）和革蘭氏陰性（G－）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。細菌的不同顯色反應是由于細胞壁對乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結構決定的。經結晶紫染色的細胞用碘液處理后形成不溶性復合物；乙醇能使它溶解，所以，染色的前二步結果是一樣的，但在G+細胞中，由于細胞壁厚、肽聚糖網層次多和交聯(lián)致密，故遇脫色劑乙醇時，因失水而網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇的處理不會溶出縫隙，因此能把結晶紫和碘的復合物(分子太大)牢牢留在壁內，使其保持紫色。反之，在G-細菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖網層薄和交聯(lián)度差，遇脫色劑乙醇后，以類脂為主的外膜迅速溶解，乙醇處理不但破壞了胞壁外膜，還可能損傷肽聚糖層和細胞質膜，這時薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫和碘的復合物的溶出，因此細胞退成無色。當再用襯托的染色液復染時，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進入已染成紫色的G+細胞，但被紫色蓋沒，紅色顯示不出來。第4頁/共8頁2、芽孢染色原理芽孢染色法是根據(jù)細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同的染料進行染色，使芽孢和菌體呈不同顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，當用弱堿性染料孔雀綠在加熱的情況下進行染色時，此染料可以進入菌體及芽孢使其著色，而進入芽孢的染料則難以透出。若再復染（蕃紅液），則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。第5頁/共8頁四、操作步驟【一】革蘭氏染色的步驟操作（一）制片1、涂片：在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作的方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂片的面積大約1～1.5cm22、干燥：將涂片于室溫中自然干燥3、固定：菌面朝上，通過火焰2—3次固定（溫度以不燙手為宜）（二）染色1、初染：在制片上滴加結晶紫染液，染色1分鐘2、水洗：傾去染色液，用水小心的沖洗3、媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1分鐘4、脫色：將玻片傾斜，連續(xù)點滴95％乙醇通過涂面，脫色20—30秒，至流出的液體無色，立即水洗5、復染：滴加番紅復染3—5分鐘6、水洗：用水洗去涂片上的番紅染色液7、晾干：將染好的涂片放在空氣中晾干或者用吸水紙吸干（三）鏡檢先用低倍，再用高倍，最后用油鏡進行觀察第6頁/共8頁【二】芽孢染色的操作步驟（改良的Schaeffer和Fulton氏染色法）1、制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)菌體于試管中，并充分混勻，制成粘稠的菌液2、加染色液：加5%的孔雀綠飽和水溶液2—3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使燃料與菌液充分混勻3、加熱：將此試管浸入沸水浴中加熱15—20分鐘4、涂片：用接種環(huán)從試管底部挑取數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干5、固定：將涂片通過酒精燈火焰3次6、脫色：用水洗，直至流出的水中無孔雀綠的顏色為止7、復染：加番紅水溶液染色