第十講 蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析

第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析第一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達一、編碼基因的專一性位點和區(qū)域性定向突變編碼基因的專一性位點突變區(qū)域性定向突變二、基因融合和基因剪接利用基因融合技術(shù)表達外源基因的緣由基因融合的策略產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導的蛋白質(zhì)分子間的連接第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達三、tRNA介導定點攙入非天然氨基酸第二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達一、目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達表達載體的一般特點與外源基因有效表達的相關(guān)因素改善表達水平及溶解性的方法二、目標蛋白質(zhì)在酵母細胞中的表達有關(guān)酵母表達載體的復制、轉(zhuǎn)錄元件外源mRNA在酵母細胞中的翻譯外源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌表達翻譯后修飾第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中的表達選擇哺乳動物細胞表達體系的優(yōu)點兩個主要的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)四、噬菌體顯示關(guān)于表達載體噬菌體顯示技術(shù)的操作噬菌體顯示技術(shù)的應用第三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象熱力學函數(shù)與熱力學平衡熱容量van’tHoff焓折疊/退折疊轉(zhuǎn)變量熱法與折疊過程熱力學第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析第四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日任何生物學問題都可以分為兩個方面，一方面是生物學的選擇，另一方面就是這種選擇何以能達到其目的。前一個問題的答案相當于給定了后一個問題的對象及其初始條件和邊界條件；后一個問題則需回答在給定條件下的給定對象何以能在物理的和化學的自然規(guī)律的支配下完成生物學所規(guī)定的功能。第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析第五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日本章要介紹的蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和可折疊性是從遺傳信息到生物功能的信息流動中的一個環(huán)節(jié)。生物學信息都包含在蛋白質(zhì)的氨基酸序列和細胞環(huán)境中，需要回答的問題是給定的序列在給定的條件下何以能在生物學所要求的時間內(nèi)達成足夠穩(wěn)定的、具有生物活力的天然結(jié)構(gòu)。已有大量實驗事實證明這個過程遵守物理化學規(guī)律。就目前我們掌握的知識而言，難點來自于兩方面。一方面是尚未有成熟的液體統(tǒng)計熱力學理論。另一方面則是多肽鏈骨架的線形共價結(jié)構(gòu)所帶來的運動學描述上的困難。第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析第六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日上個世紀50年代后期，特別是在遺傳密碼的分子基礎(chǔ)被建立起來之后，Anfinsen及其同事關(guān)于多肽鏈重新折疊的工作激發(fā)了對于折疊過程的物理化學的興趣。具有適當初級序列的多肽鏈折疊成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)，使得從遺傳信息到生物功能的信息傳遞表達過程得以完成。在正確的物理化學條件下，蛋白質(zhì)的折疊是自發(fā)的；在不正確的物理化學條件下，蛋白質(zhì)通常沒有緊致而特定的結(jié)構(gòu)。在這個意義上，我們說蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)只取決于它的氨基酸序列?；蛞坏┍磉_，即被翻譯為一定的多肽序列，熱力學就代替生物學機制起主導作用。原本是柔性、不規(guī)則的多肽鏈就折疊為生物學功能所需要的、更緊致、特定的結(jié)構(gòu)。第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日作為蛋白質(zhì)分子的多肽鏈是具有氨基酸側(cè)鏈的線形分子。在被合成以后，除了部分多肽鏈會經(jīng)歷合成后加工，也有一些會發(fā)生二硫鍵的形成與斷裂外，多肽鏈的共價鍵不再變化。在蛋白質(zhì)折疊過程的研究中，只有二硫鍵的形成與斷裂是共價結(jié)構(gòu)的變化。二硫鍵的變化也強烈地依賴于溶液中相應的氧化還原劑的存在。繞著雙原子共價鍵的旋轉(zhuǎn)，可以改變分子的三維結(jié)構(gòu)。繞單鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱為構(gòu)象角，給定一組構(gòu)象角，就給出了多肽鏈的一個結(jié)構(gòu)。所以，構(gòu)象（視具體問題，常僅指主鏈構(gòu)象）常被用來指多肽鏈的三維結(jié)構(gòu)?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在構(gòu)象取定以后，多肽鏈仍可完成復雜的內(nèi)部運動。要對這種內(nèi)部運動有所了解，或者說想要知道在通常的條件下，哪些運動形式較為可能發(fā)生，哪些較不容易發(fā)生，需要對溶液中的熱運動有所了解。在蛋白質(zhì)溶液中，所有分子都在不停地運動，這就是熱力學所討論的熱運動。這種熱運動既包括了分子相對于容器的運動，又包括了分子內(nèi)部各部分之間的相對運動。要確定某一時刻蛋白質(zhì)分子的運動狀態(tài)是非常困難的，甚至是不可能的。但是蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)不僅取決于多肽鏈與溶液分子間的瞬時的相互作用，而且取決于它們永不停頓的熱運動，所以先對熱運動本身有一定的了解是有益的?！鲆?、熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日對于單原子理想氣體來說，每個原子的速度遵從麥克斯韋-玻爾茲曼分布，對于雙原子分子，由于振動能級的量子化，能量均分定理不再成立。常溫下雙原子分子的振動能級很少被激發(fā)。在多原子分子中，圍繞雙原子鍵的旋轉(zhuǎn)不是完全自由的，這種旋轉(zhuǎn)需克服一定的位壘。繞雙原子鍵的轉(zhuǎn)動主要表現(xiàn)為在平衡位置附近的擺動，這是另一種形式的振動。只有靠熱運動的漲落，繞雙原子鍵的旋轉(zhuǎn)才可能實現(xiàn)。在多原子分子中，繞雙原子鍵的轉(zhuǎn)動常牽涉眾多原子的位置變動和引起多原子分子構(gòu)象的變化，這應該是多肽鏈折疊過程所涉及的主要運動形式。振動常指在保持構(gòu)象不變的條件下，原子在平衡位置附近的運動。作為多原子分子的多肽鏈，圍繞平衡構(gòu)象的振動更是一個非常復雜的運動系統(tǒng)?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在熱平衡條件下，在宏觀上觀察到的一種“狀態(tài)”，包含了許多以不同概率發(fā)生的微觀狀態(tài)。每個微觀狀態(tài)需要由各個分子的位置、取向、平動及作為整體的轉(zhuǎn)動狀態(tài)以及各個分子的內(nèi)部運動狀態(tài)所描述?？梢约僭O許多不同的宏觀狀態(tài)，每種宏觀狀態(tài)有不同的微觀狀態(tài)概率分布，同時自己也有一定的發(fā)生概率。熱力學平衡態(tài)就是有最大概率的宏觀狀態(tài)。蛋白質(zhì)的天然態(tài)和退折疊態(tài)都是熱力學的平衡態(tài)?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日目前對液態(tài)水的了解遠不如對氣態(tài)水和固態(tài)水的了解。液態(tài)中的熱運動非常復雜，尤其是蛋白質(zhì)所在的水溶液本身就是一種極復雜的液體。在液態(tài)水中，相鄰水分子以一定的概率形成氫鍵，因而存在一定范圍的氫鍵網(wǎng)絡。氫鍵網(wǎng)絡的數(shù)目、形狀、延伸的范圍都在不停地變化。無法像考慮整塊冰的內(nèi)部運動那樣去分析每一個獨立氫鍵網(wǎng)絡的內(nèi)部運動，更不用說去分析相連網(wǎng)絡間的相互作用和相對運動。應該認識到，同樣的困難存在于對多肽鏈熱運動的分析中?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日除了多肽鏈自身以外，多肽鏈還與溶劑分子存在相互作用。尤其是當有氫鍵或離子鍵、配位鍵等較強的相互作用存在時，多肽鏈與這些溶劑分子（水分子和各種金屬離子等）形成一個整體，這使得多肽鏈的內(nèi)部運動模式發(fā)生顯著的變化。由于與多肽鏈相互作用的強度和溶劑分子（主要是水分子）的數(shù)目總是在不停地變化，造成了分析蛋白質(zhì)分子內(nèi)部熱運動的固有困難。一般來說，與溶劑分子的相互作用增加了蛋白質(zhì)的有效分子量和內(nèi)部運動自由度，這使內(nèi)部運動的能級增加，分布變寬、加密。也使得可以被激發(fā)的內(nèi)部運動增加。當然，另一方面的后果是純?nèi)軇┰谡麄€溶液中所占比例的減少。■一、熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日對于我們了解熱運動來說，除了應該知道平均的熱運動能量外，還應了解熱運動的漲落。任何體系的能量分布都有一定的寬度，這個寬度反映了體系能量圍繞平均值或最可能值的漲落。對于大的體系，比如具有宏觀尺度的體系，相對來說，分布是非常尖銳的，相應的漲落很難察覺。但是當體系變小時，漲落相對地（與體系的總能量相比）就會變得較大。這種漲落現(xiàn)象可以在布朗運動中觀察到。對于像蛋白質(zhì)分子那樣小的體系，熱力學能量的漲落就會是非常顯著的。熱力學能量的漲落在蛋白質(zhì)的動力學性質(zhì)中起著確定的作用。正是熱運動的漲落，使多肽鏈可以聚集足夠的能量以克服改變構(gòu)象角所需要克服的位壘，并完成折疊或去折疊過程。各種程度漲落發(fā)生的概率決定多肽鏈構(gòu)象變化的速度?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日通過多肽鏈各部分之間和多肽鏈與溶液分子之間的相互作用，熱運動可以在溶液中和多肽鏈的各部分之間傳播。當在空間的一定范圍內(nèi)和在時間的一定間隔內(nèi)的平均熱運動能量不再隨時間變化時，體系就達到了熱力學平衡。在熱力學平衡條件下，絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)分子有一個較為穩(wěn)定（與其他構(gòu)象相比，穩(wěn)定自由能約為數(shù)百千焦每摩）而且緊致的（即所有殘基緊密地堆積在一起）構(gòu)象。這時，多肽鏈的絕大多數(shù)構(gòu)象角有確定值（或者說確定的平均值）。這個穩(wěn)定而緊致的構(gòu)象就是蛋白質(zhì)的天然態(tài)?！鲆?、熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日多肽鏈的主鏈上含有氨基和羧基，側(cè)鏈則取決于氨基酸序列而可以具有非常不同的親疏水性和帶電性質(zhì)?？梢灶A料，它在水溶液中與水分子及其他溶劑分子的相互作用會非常強地依賴于它的氨基酸序列。一段親水的極性氨基酸序列顯然有選擇更多地與水分子結(jié)合的傾向，而一段疏水的氨基酸序列則會傾向于被包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。對于隨機合成的多肽鏈，也可以期望它在水溶液中的可能構(gòu)象呈現(xiàn)出像它的可能的序列一樣的多樣性?！鲆弧徇\動與蛋白質(zhì)構(gòu)象第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在完全不考慮化學鍵的變化時多肽鏈的內(nèi)能E由構(gòu)象和內(nèi)部運動所確定。體系的焓為：H

＝E

＋pV式中，p為大氣壓力；V為體系體積。蛋白質(zhì)的天然態(tài)總是在多肽鏈與環(huán)境（通常是水溶液）的相互作用中形成而穩(wěn)定的。多肽鏈的構(gòu)象變化總是伴隨著溶液的變化。往往難于描述的就是溶液的變化。式中的內(nèi)能和焓均應包含溶液所作的貢獻以及多肽鏈與溶液相互作用所作的貢獻。由于這些貢獻是分析的難點，對它們的了解有限，故常常只作為隱含內(nèi)容存在。體積V是整個溶液的體積。體積的變化往往很小，所以，許多文獻常常不區(qū)分內(nèi)能與焓?！龆?、熱力學函數(shù)與熱力學平衡第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日■二、熱力學函數(shù)與熱力學平衡第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日假定多肽鏈有N和U兩種穩(wěn)定狀態(tài)，比如說N為天然狀態(tài)；U為失活或退折疊狀態(tài)。在狀態(tài)N，多肽鏈有確定的構(gòu)象，不確定的是它的內(nèi)部運動。狀態(tài)U的情況就可能很復雜，它可能有幾個、許多個或往往是無數(shù)個可能的構(gòu)象，它以不同的概率選擇它所可能采取的構(gòu)象。在狀態(tài)U，也有可能一條多肽鏈只有它長度上的一段不再停留在天然狀態(tài)，而其余部分仍與天然態(tài)相同。一句話，失活態(tài)或退折疊態(tài)包含了天然態(tài)以外的其他任何狀態(tài)，而且蛋白質(zhì)分子不停地在可能狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變。■二、熱力學函數(shù)與熱力學平衡第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日需要注意下述事實。首先，在多肽鏈的兩種狀態(tài)（N與U）平衡共存的時候，體系也有自己的自由能、焓和熵等熱力學量，只是沒有明顯地用到它們。

其次，體系的熱力學平衡是由體系自由能極小決定的。在平衡達成時各種組分（處于狀態(tài)N或狀態(tài)U的分子）所占比例，取決于它們的標準自由能之差。最后，無論是從熱力學還是從統(tǒng)計力學來看，熵都是一個有明確定義的物理量。熵的變化可以用實驗方法測定。在簡單的例子中，熵也可以用統(tǒng)計力學方法計算。■二、熱力學函數(shù)與熱力學平衡第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日量熱實驗，尤其是近30年發(fā)展起來的使用微分掃描量熱儀的實驗，使得在蛋白質(zhì)的折疊或退折疊轉(zhuǎn)變過程中，直接測定熱容量的變化成為可能，也使得測定在這些轉(zhuǎn)變過程中如焓和熵這樣一些熱力學量的變化成為可能。在使用微分掃描量熱儀的實驗中，儀器以恒定的速率加熱放在量熱池中的蛋白質(zhì)溶液，同時被加熱的還有另外一個作為參照的裝有緩沖液的量熱池。仔細地分別加熱兩個量熱池，使樣品池和參考池在溫度逐漸升高或降低的過程中始終保持相同的溫度。為維持相同溫度，兩個量熱池在熱量需求上的差別，就是兩個池中液體熱容量的差別。這個熱容量差反映了熱過程中的能量信息?！鋈崛萘康谝还?jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在測定蛋白質(zhì)構(gòu)象平衡轉(zhuǎn)變的實驗中，引起平衡移動的因素并不總是溫度，其他的如失活劑濃度的改變，也可以引起蛋白質(zhì)的折疊/退折疊轉(zhuǎn)變。在這些實驗中，構(gòu)象變化常常是用譜學方法監(jiān)測的。平衡常數(shù)根據(jù)監(jiān)測參量的變化間接得到。由于沒有直接測量熱，折疊/退折疊轉(zhuǎn)變的焓變也不能測出。但是，如果在不同溫度下完成這些實驗，利用vantHoff作圖，就可以從平衡常數(shù)隨溫度的變化關(guān)系中得到vantHoff焓。vantHoff焓的應用主要在對“兩態(tài)轉(zhuǎn)變”模型的分析中?！鏊?、van'tHoff焓第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的失活可以由許多因素引起，溫度、pH值和失活劑的濃度增加都可引起蛋白質(zhì)失活。我們已經(jīng)提到蛋白質(zhì)的失活狀態(tài)是多種多樣的。當有不可溶的聚集體或沉淀形成時，失活過程是不可逆的。由于對不溶的聚集體的研究存在困難，目前還不能從對這些沉淀物的研究中得到多少信息。所以，人們更感興趣的是對從活性態(tài)到失活態(tài)的可逆轉(zhuǎn)變過程的研究。一般在可逆的折疊/退折疊實驗中，通過調(diào)節(jié)某一個可以引起多肽鏈發(fā)生折疊/退折疊轉(zhuǎn)變的溶液條件，同時用熒光、紫外線吸收、圓二色或核磁等譜學方法來監(jiān)測多肽鏈的結(jié)構(gòu)變化?！鑫?、折疊/退折疊轉(zhuǎn)變第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日與用一般譜學方法對蛋白質(zhì)折疊/退折疊過程的監(jiān)測不同，用微分掃描量熱計對折疊／退折疊過程的監(jiān)測可以測定熱力學量的變化，因而提供更多的有關(guān)熱過程的能量學信息。用微分掃描量熱計直接測定的是蛋白質(zhì)溶液的熱容量與參考緩沖液熱容量之差隨溫度的變化。對于眾多的折疊/退折疊實驗來說，只有使用微分掃描量熱計的實驗能夠直接側(cè)定退折疊過程中每摩爾蛋白質(zhì)分子所吸收的熱量（即量熱焓△Hcal)，這是微分掃描量熱計的獨特能力?！隽?、量熱法與折疊過程熱力學第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日多年來用包括微分掃描量熱計在內(nèi)的許多實驗方法所做的研究表明，如果用熱力學自由能的語言來表述的話，蛋白質(zhì)的折疊態(tài)與退折疊態(tài)相比只具有不顯著的穩(wěn)定性。在近生理條件下，退折疊態(tài)和折疊態(tài)間的實驗自由能差通常在20~60kJ/mol范圍內(nèi)，這反映出平均每個氨基酸殘基對穩(wěn)定自由能的貢獻比在相同條件下的平均熱運動能小許多，同時也強調(diào)了蛋白質(zhì)折疊的協(xié)同性。殘基間單個的相互作用不足以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的構(gòu)象，但它們合起來的協(xié)同作用卻能夠做到?！隽?、量熱法與折疊過程熱力學第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊一、折疊動理研究技術(shù)二、兩態(tài)動理三、過渡態(tài)折疊過程與過渡態(tài)對折疊過渡態(tài)的性質(zhì)分析四、折疊中間態(tài)熔球態(tài)快態(tài)與慢態(tài)二硫鍵引起的中間態(tài)多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析五、折疊的基本過程接觸形成螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變-發(fā)卡形成第二十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的天然態(tài)和退折疊態(tài)都是可以用熱力學方法鑒別的多肽鏈的不同狀態(tài)。雖然退折疊態(tài)并未得到充分的研究，在各種實驗條件下存在的退折疊態(tài)也不盡相同，但一般地仍可以認為可以重折疊的退折疊態(tài)是多肽鏈在熱力學平衡狀態(tài)下存在的構(gòu)象不停地變化的狀態(tài)。熱力學平衡可以向天然態(tài)方向移動，也可以向退折疊態(tài)方向移動，取決于環(huán)境條件的變化，于是有了平衡態(tài)的折疊和退折疊轉(zhuǎn)變過程。第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第二十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在對體系平衡轉(zhuǎn)變的研究中，每一次環(huán)境條件改變后，無論這種改變多么微小，都應耐心地等待體系建立起新的平衡，再進行下一次測量，否則，可能會發(fā)現(xiàn)測量結(jié)果是與連續(xù)兩次測量之間的時間間隔有關(guān)的。注意到這種現(xiàn)象后，從另一個角度來思考，可以提出這樣的問題：對于任何給定的環(huán)境條件變化，蛋白質(zhì)的狀態(tài)將作出怎樣的時間響應？換句話說，從熱力學平衡轉(zhuǎn)變研究的結(jié)果可以預期到的平衡的移動是如何在一系列的時間序列中一步一步地達到的？這就提出了折疊過程動理學的問題。雖然在折疊/退折疊過程研究中所著眼的只是多肽鏈構(gòu)象的變化，一般并不涉及化學鍵的改變，但用于化學反應動理學研究的許多成熟的實驗技術(shù)和理論概念都被用來研究蛋白質(zhì)的折疊/退折疊動理。

第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第二十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日從化學反應的觀點來看，從天然態(tài)（N）到退折疊態(tài)（U）的轉(zhuǎn)變可以看成是一個可逆的化學反應：NU首先提出的問題是，在轉(zhuǎn)變中有沒有中間態(tài)？如果沒有中間態(tài)，那么反應就是一個簡單的兩態(tài)轉(zhuǎn)變；如果有中間態(tài)，那么有哪些中間態(tài)？它們在結(jié)構(gòu)上有什么特征？它們的相對穩(wěn)定性如何？哪一個是最穩(wěn)定并因而是決定反應速率的中間態(tài)？第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第二十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日其次，不管是單步的兩態(tài)轉(zhuǎn)變，還是由多步反應組成的復雜過程，每步反應是否有過渡態(tài)？如果有的話，過渡態(tài)在結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性上有什么特征？原則上，當把所有中間態(tài)和過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及它們在折疊路徑上的位置都搞清楚之后，折疊過程就在動理上弄明白了。這當然是非常困難的任務，因為折疊中間態(tài)是在短暫的時間內(nèi)形成的，它們又只有很短暫的壽命。只有那些后繼步驟進行得很慢，因而可以積累到一定數(shù)量的中間態(tài)才有可能得到研究。至于過渡態(tài)，它們的壽命更短，因為從概念上來說，它們是折疊過程中最不穩(wěn)定的暫時狀態(tài)。并且，過渡態(tài)概念是否能一般地適用于蛋白質(zhì)折疊過程，仍然是值得懷疑的問題。

第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日對過渡態(tài)概念適用性的懷疑產(chǎn)生于退折疊態(tài)的復雜性。蛋白質(zhì)的退折疊態(tài)在構(gòu)象上是不均一、多種多樣的，這使得折疊和退折疊反應都是多重并行的。這些并行的反應在過程的某些階段有可能會合并起來，或者保持分離一直到反應結(jié)束，這使得蛋白質(zhì)折疊的動理更加地復雜化了。第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日最后，從科學研究應由簡到繁、由淺入深的規(guī)律來看，在折疊動理研究中首先應當研究的是兩個殘基間形成接觸這樣的基本過程。由于快速混合技術(shù)的發(fā)展，從殘基間接觸形成、螺旋和發(fā)卡形成、直到單結(jié)構(gòu)域小蛋白質(zhì)的折疊，這樣一些快速的簡單的折疊過程的研究揭示了蛋白質(zhì)折疊過程中最本質(zhì)的特征。尤其是小蛋白質(zhì)折疊速率只與反映天然結(jié)構(gòu)中殘基間相互接觸的長程性的簡單特征有關(guān)的事實，更加深了我們對折疊過程物理本質(zhì)的理解。第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在化學反應動理研究中常采用反應流（flow）技術(shù)和流動停止（stopped-flow）技術(shù)。這些技術(shù)只需要較少的樣品，又可以得到較高的時間分辨率，所以得到了廣泛的應用。在反應流方法中，參與反應的各種組分被注入一個管道中，并在其中連續(xù)地流動。各組分在向前流動的同時，由于混流和擴散（熱運動）而相互混合并發(fā)生化學反應。在管道的不同位置安裝用于監(jiān)測反應進程的裝置，就可以觀察體系狀態(tài)隨時間的變化?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日如果各組分的混合過程較慢，有些部分已開始反應，而另外一些部分尚未混合，觀察就會受到擴散等混合過程的干擾，使實驗結(jié)果難于解釋。這種干擾很難排除，于是產(chǎn)生了由于混合過程不是無限快而產(chǎn)生的測量的“死時間”。在流動停止法中，把需要混合的液體快速地注入空腔?？涨恢醒b有活塞，當液體注入時活塞后退；當活塞退到一個止點時液體停止流動，快速混合起來的液體則繼續(xù)發(fā)生反應。這種方法只需要很少量的樣品，因而在蛋白質(zhì)折疊動理的研究中得到了廣泛應用。在通常的流動停止裝置中混合的死時間大約是lms?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日我們目前關(guān)于蛋白質(zhì)折疊/退折疊動理的大部分知識都來自于流動停止法實驗所獲得的無數(shù)有價值的信息。但是這些方法有一個基本的缺陷，與快速的蛋白質(zhì)折疊相比，它的時間分辨率仍然太低，毫秒量級的死時間對于蛋白質(zhì)折疊中的許多重要事件來說是不夠快的。在許多實驗中典型的情況是，在這個死時間之內(nèi)多數(shù)的（有時是所有的）與折疊有關(guān)的譜學變化已經(jīng)完成，因而根本無法監(jiān)測到結(jié)構(gòu)的變化過程。在對合成的多肽鏈的研究中發(fā)現(xiàn)，像a螺旋形成那樣的基本過程發(fā)生得太快，以致無法用流動停止法來觀察?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日由于技術(shù)的進步和研究工作的需要，發(fā)展出了研究快速折疊的方法。這些方法可以分為光化學觸發(fā)溫度或壓力躍變超快混合技術(shù)■一、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一個超快折疊研究采用了光化學觸發(fā)技術(shù)，即用短脈沖激光來觸發(fā)失活的細胞色素c中一氧化碳的光解，這個實驗利用了一氧化碳與失活蛋白質(zhì)中的血紅素的結(jié)合比與天然蛋白質(zhì)中的血紅素的結(jié)合要緊密得多這一事實。在與一氧化碳結(jié)合的狀態(tài)，失活的蛋白質(zhì)更穩(wěn)定；而在失去一氧化碳的時候，天然的蛋白質(zhì)更為穩(wěn)定，于是一氧化碳的光解就可以起動失活蛋白質(zhì)的重折疊。因為光解發(fā)生在小于皮秒的時間內(nèi)，這種方法對于折疊實驗來說具有無限制的時間分辨率?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日一種在概念上相似但更一般的方法是用光誘導的電子遷移反應來起動折疊。第一個這樣的實驗也是用細胞色素c完成的。還原形態(tài)的細胞色素c比氧化形態(tài)的更穩(wěn)定。導致這種穩(wěn)定性差別的最基本的原因是在天然蛋白質(zhì)中80位的甲硫氨酸與血紅素鐵離子之間的化學鍵的穩(wěn)定性增加。釘bL-吡啶絡合物或NADH的光激發(fā)產(chǎn)生一個長壽命的激發(fā)態(tài)，可以作為強還原劑。注入一個電子后，在數(shù)微秒的時間內(nèi)，細胞色素c的血紅素鐵離子就從三價還原為兩價，并使折疊起動。■一、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日另外一種不同的光觸發(fā)方法使用光失穩(wěn)的二硫鍵，它不需要一個金屬結(jié)合位點，因而可以用于更廣范圍的蛋白質(zhì)的觸發(fā)。在這種方法中，用二硫鍵交聯(lián)多肽鏈片段，只要恰當?shù)卦O計交聯(lián)位置，就會使蛋白質(zhì)被限制在錯誤的構(gòu)象中。二硫鍵的光切可以發(fā)生在亞皮秒時間內(nèi)，從而快速地觸發(fā)重折疊?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第二類光觸發(fā)使用激光脈沖以產(chǎn)生溫度躍變，這是一種可以更廣泛地采用的方法，因為任何產(chǎn)生顯著焓變的折疊/退折疊過程的平衡都會受到溫度躍變的擾動。這種方法的第一個實驗通過用工作在532nm波長的皮秒激光加熱染料溶液來實現(xiàn)的，這一實驗的時間分辨率是約70ps，這個分辨率取決于使熱量從熱的染料分子擴散到溶劑分子所需要的時間?！鲆弧⒄郫B動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日像尿素和鹽酸胍那樣的失活劑在蛋白質(zhì)折疊實驗中一直起著中心的作用。幾乎所有蛋白質(zhì)都可以在足夠高的失活劑濃度下退折疊并保持可溶，所以失活劑的稀釋將繼續(xù)保持為起動蛋白質(zhì)折疊的極重要的方法。由于這個原因，相當?shù)呐τ迷诓捎眠B續(xù)流方法以提高混合實驗的時間分辨率上。最近有兩種這樣的方法被用于蛋白質(zhì)折疊，一種基于湍流混合，另一種基于流體力學聚焦?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在湍流混合法中，液體被強迫以高速穿過一個狹縫，高剪切力產(chǎn)生的湍流把液體“粉碎”稱為湍流泡（渦旋）的非常小的體積元。由于失活劑的擴散只需越過很短的距離，混合過程很快（l~10s）。在這種實驗中，混合液體以恒定速度連續(xù)流動。在由混合器引出的噴管的不同位置上進行動理監(jiān)測，時間通過距混合區(qū)域的距離和流動速度來測定。動理測量的第一個時間點顯著地長于混合時間，因為混合溶液需要流過一個對監(jiān)測用的探測器是不可及的體積。但是，這些儀器的死時間只有50~2s，這比流動停止法改進了一個數(shù)量級以上?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第二種快速混合方法采用流體力學聚焦技術(shù)，以產(chǎn)生一股與容器內(nèi)周圍液體接觸并以恒定速度流動的微觀或亞微觀厚度的蛋白質(zhì)溶液流。通過液體以擴散方式進入或退出這一狹窄的蛋白質(zhì)溶液流，兩種液體發(fā)生混合。蛋白質(zhì)溶液曾經(jīng)被聚焦到50nm那樣小的寬度，這對應于約1s的混合時間?！鲆?、折疊動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日與湍流混合法相比，這種技術(shù)應該能夠顯著地減小有效死時間。流體力學聚焦技術(shù)的一個優(yōu)點是液體流是層狀的，結(jié)果使得在混合器中，所有成分在所有位置的濃度（包括在混合區(qū)域）原則上都是可以用理論方法計算和用實驗方法測定的。采用這種技術(shù)，應用亞毫秒時間分辨的小角X光散射法成功地測量了蛋白質(zhì)折疊過程中過渡態(tài)的慣量半徑?！鲆弧⒄郫B動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日最后，蛋白質(zhì)折疊動理可以在平衡態(tài)用動力學核磁共振方法來研究。對于經(jīng)歷兩態(tài)折疊/退折疊轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)，如果這兩種狀態(tài)的共振頻率和轉(zhuǎn)換弛豫時間都是已知的，則折疊和退折疊兩者的速率都可以從線寬測量出來。在10s~10ms范圍內(nèi)，當折疊態(tài)和退折疊態(tài)都有顯著的分子分布時，這種方法用來測定轉(zhuǎn)變速率是很有用的?！鲆弧⒄郫B動理研究技術(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日許多小蛋白質(zhì)的折疊是協(xié)同的兩態(tài)轉(zhuǎn)變。在不同的溶液條件下（如不同溫度、pH值或失活劑濃度），溶液有不同的平衡常數(shù)。天然態(tài)和退折疊態(tài)分子在樣品中所占分數(shù)可以用動理學和平衡熱力學兩種方法測到，這提供了嚴格的方法來檢驗蛋白質(zhì)折疊反應的兩態(tài)特征。實驗表明，動理測量得到的天然態(tài)和退折疊態(tài)分子所占分數(shù)與在同樣的溶液條件下用平衡轉(zhuǎn)變測量得到的相符?！龆蓱B(tài)動理第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日對那些快速折疊蛋白的實驗表明，在小于毫秒的時間內(nèi)，包含在氨基酸序列中的信息就可以被翻譯成最終的天然的三維結(jié)構(gòu)，這比人們早先所持有的看法快得多。這些小蛋白質(zhì)在它們的折疊中遵守兩態(tài)機理，同時，甚至在通常折疊和退折疊達成平衡最慢的地方―折疊轉(zhuǎn)變的中點―它們也能極快地折疊。快速折疊的特征與二級結(jié)構(gòu)的大小有關(guān)。所有快速折疊的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段所包含殘基數(shù)都小于100個。■二、兩態(tài)動理第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★1折疊過程與過渡態(tài)在化學反應中速率是由始態(tài)與終態(tài)之間的位壘決定的。這個位壘的位置定義一個過渡態(tài)。反應物只有越過這個位置才能生成產(chǎn)物達到終態(tài)，所以又把過渡態(tài)稱為活化態(tài)。按過渡態(tài)理論，過渡態(tài)與基態(tài)（始態(tài)和終態(tài)）處于準化學平衡狀態(tài)。因而一些平衡熱力學量可以從反應速率常數(shù)對溫度的依賴關(guān)系得到，就如同反應的熱力學參數(shù)可以從平衡常數(shù)對溫度的依賴性得到一樣?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★1折疊過程與過渡態(tài)過渡態(tài)理論是在研究小分子的化學反應中發(fā)展起來的，用以描述反應中化學鍵的形成與斷裂過程的熱力學。這種理論是否適合于描述蛋白質(zhì)分子的折疊/退折疊過程，應該是有疑問的?！鋈?、過渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第四十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★1折疊過程與過渡態(tài)蛋白質(zhì)的折疊涉及協(xié)同地形成許多微弱的非共價相互作用，并且天然構(gòu)象的形成是沿著一條梯度十分平緩的路徑進行的，因而可以非常令人信服地假定，在退折疊態(tài)和天然構(gòu)象間存在許多不同的路徑。在最極端的情況下，溶液中每一個蛋白質(zhì)分子在折疊中都有自己獨特的路徑。很清楚，如果折疊沒有惟一的路徑，那么，也不會有惟一的熱力學過渡態(tài)?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日過渡態(tài)理論的中心假定是過渡態(tài)與基態(tài)在準熱力學平衡中共存，雖然過渡態(tài)只有非常短的壽命。對于只有很少自由度的小分子來說，這種假定是很合理的，但對于蛋白質(zhì)卻不一定成立。對處于過渡態(tài)的蛋白質(zhì)鏈，可以達到的構(gòu)象空間仍然是非常大的，因而在過渡態(tài)存在的短暫時間內(nèi)，不可能對這個空間做完全的取樣。■三、過渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日由于對折疊的本質(zhì)尚未很好地理解，很清楚，不可能在理論的基礎(chǔ)上判斷折疊是否由過渡態(tài)控制。但幸運的是，蛋白質(zhì)的折疊反應滿足幾個受過渡態(tài)控制的過程所滿足的實驗標準。①在蛋白質(zhì)折疊中存在一個把天然態(tài)和退折疊態(tài)分開的位壘。這個位壘的存在決定了許多平衡退折疊轉(zhuǎn)變具有與一級相變類似的兩態(tài)特征?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日②小蛋白質(zhì)的折疊動理遵守化學動理的簡單規(guī)律，即蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)在折疊過程中的變化遵守單指數(shù)動理規(guī)律。這確認了在退折疊態(tài)和天然態(tài)之間存在一個共同的位壘，所以事實上所有分子在折疊中都要遇到它?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日③在相同終態(tài)而不同始態(tài)的條件下，可以觀察到退折疊／重折疊的相同的速率常數(shù)。這證明，在進入新的溶液條件準備開始折疊的時候，蛋白質(zhì)分子間存在決速的預平衡，以致(退折疊態(tài)的多樣性)并不影響折疊的限速事件。換句話說，折疊中的分子并不保存對它們早先退折疊狀態(tài)的歷史的記憶（這種歷史對單個的蛋白質(zhì)分子可能是不同的）。當然，這一點對于一些有復雜因素介入的退折疊分子是不成立的，這些復雜因素包括脯氨酰順反異構(gòu)、二硫鍵連接的鏈套的拓撲異構(gòu)或與輔因子相互作用的方式不同?！鋈?、過渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日一些實驗事實一起證明蛋白質(zhì)折疊確實是受活化控制的過程，所以過渡態(tài)理論廣泛地用于分析過渡態(tài)的性質(zhì)。在平衡條件下過渡態(tài)不會有顯著的分子布居，所以過渡態(tài)的性質(zhì)只能根據(jù)反應速率常數(shù)及其對體系變化的反應間接推斷。常常采用兩種互相補充的實驗方法?！鋈?、過渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在第一種方法中，變化折疊實驗的條件（如溶劑成分和溫度）以從所引起的退折疊和重折疊微觀速率常數(shù)的改變中確定過渡態(tài)的熱力學性質(zhì)。在第二種方法中，用定點突變改變被研究的蛋白質(zhì)，以探測突變殘基對過渡態(tài)能量的貢獻。兩種方法的相同前提是，無論是對折疊條件還是對蛋白質(zhì)進行的改變，都不要改變過渡態(tài)本身，而只是改變過渡態(tài)相對于退折疊態(tài)和天然態(tài)的穩(wěn)定性?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★2對折疊過渡態(tài)的性質(zhì)分析對過渡態(tài)性質(zhì)的分析通?；谶^渡態(tài)理論所假定的一個簡單的反應圖（圖45）。退折疊的活化吉布斯自由能等于天然態(tài)和過渡態(tài)間的自由能差，而重折疊的活化吉布斯自由能等于退折疊態(tài)和過渡態(tài)間的吉布斯自由能之差?！鋈⑦^渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日圖4-6兩態(tài)折疊反應的反應坐標圖。橫坐標為反應坐標，縱坐標為吉布斯自由能。反應向右進行時為退折疊，向左進行為重折疊。活化能一般情況下高于退折疊平衡自由能。值顯示沿反應坐標過渡態(tài)與折疊態(tài)和退折疊態(tài)的相對位置。當值接近于1時過渡態(tài)接近于折疊態(tài)；當值接近于零時過波態(tài)接近于退折疊態(tài)?！鋈?、過渡態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★1熔球態(tài)某些蛋白質(zhì)在平衡態(tài)下確實可以半折疊的狀態(tài)存在。可以通過把蛋白質(zhì)暴露于中等濃度的失活劑中，或低pH值下，或加鹽的溶液中，來產(chǎn)生這些穩(wěn)定的形式。不同蛋白質(zhì)的部分折疊的中間態(tài)共同享有一些基本的特征。它們通常是緊致的，直徑只比各自的天然態(tài)的直徑大10％~20％。■四、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第五十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★1熔球態(tài)用圓二色性在酰胺區(qū)域的檢驗顯示它們與天然蛋白質(zhì)有相同的螺旋度。殘基間特異的非局域的三級堆積相互作用似乎在這些形式中已經(jīng)消失了，結(jié)果，這些中間態(tài)在芳香區(qū)域沒有圓二色性，1H-NMR信號也不如在天然蛋白質(zhì)中那樣彌散。這些部分折疊的狀態(tài)稱為“熔球態(tài)”，雖然含意各有不同變化，但這個名稱仍得到了廣泛的使用?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日就在平衡轉(zhuǎn)變研究中發(fā)現(xiàn)熔球態(tài)以后，在折疊的動理研究中也發(fā)現(xiàn)熔球態(tài)是具有中心意義的中間態(tài)。假定在蛋白質(zhì)鏈折疊的早期就迅速地蜷縮為一種租略的球形，并且如果同時伴隨著以氫鍵結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)的自發(fā)而廣泛地形成時，這樣的蜷縮就是最有效的。氫鍵減少了蛋白質(zhì)骨架的極性，因而增加了疏水蜷縮的驅(qū)動力。隨著二級結(jié)構(gòu)之間的裝配，這些氫鍵轉(zhuǎn)移到低極性區(qū)域后變得更加穩(wěn)定。疏水相互作用與氫鍵的這種相互加強的效應提示，甚至在早期階段折疊就已經(jīng)是一個協(xié)同過程?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日熔球態(tài)的研究集中在如a-乳清蛋白、葡萄球菌核酸酶和肌球蛋白那樣的小蛋白質(zhì)上。在具有較弱三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，或在三級相互作用由于緊密結(jié)合的輔助因子（如肌紅蛋白中的血紅素，或a-乳清蛋白中起穩(wěn)定作用的Ca2+）被移走而減弱了的蛋白質(zhì)中，最容易觀察到熔球類型的中間態(tài)?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日實驗數(shù)據(jù)表明，三種蛋白質(zhì)―脫輔基--乳清蛋白、葡萄球菌核酸酶和脫輔基肌紅蛋白―的半折疊中間態(tài)展示出可以分為兩部分的結(jié)構(gòu)。在這種中間態(tài)，蛋白的一部分有定義得相當明確的三級結(jié)構(gòu)和最少是部分的非局域相互作用，而剩下的部分則以退折疊形態(tài)為主。這些蛋白質(zhì)的實際狀態(tài)不同于原本意義上的熔球態(tài)。在原來的意義上，熔球態(tài)展示出以類天然的二級結(jié)構(gòu)和三級相互作用的喪失為特征的整體上松散了的結(jié)構(gòu)?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★2快態(tài)與慢態(tài)蛋白質(zhì)折疊與一般化學反應不同的一點是退折疊態(tài)在構(gòu)象上的多種多樣性。如果所有分子都要以相同的路徑折疊，相對于整體的折疊速率來說，這些處于退折疊態(tài)的分子必須非?？焖俚卦诟鞣N構(gòu)象間轉(zhuǎn)變。由于導致構(gòu)象變化的繞雙原子鍵的轉(zhuǎn)動只需克服繞單鍵的低的而且彼此相差不大的位壘，對于那些較短的多肽鏈來說，這個條件可能容易滿足。但是，當肽鏈變長、天然態(tài)的結(jié)構(gòu)變得復雜時，退折疊態(tài)或半退折疊態(tài)的各種構(gòu)象在壽命上的差別就會顯現(xiàn)出來。所以，一點也不奇怪，中間態(tài)的存在是更常見的情形，尤其是存在一些可以導致構(gòu)象轉(zhuǎn)變的更慢的過程。脯氨酸肽鏈的順反異構(gòu)化就是這樣的慢過程，二硫鍵的形成和斷裂則是更慢的過程?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日如果用快速混合技術(shù)來研究蛋白質(zhì)的動理學就會發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質(zhì)的部分分子在以秒計的時間或更短的時間內(nèi)達到它們的天然態(tài)，而剩下的分子的折疊則慢得多，往往要等待數(shù)分鐘它們才能達到天然態(tài)。在以同樣的天然態(tài)為終點的重折疊實驗中，很容易發(fā)現(xiàn)快和慢兩種不同的動理相。而在失活劑存在下的退折疊則常常是單相過程?？斓恼郫B（UF）和慢的折疊（US）同時存在的過程可以用下面的方程來表示：■四、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在體內(nèi)條件下，有多種脯氨酰異構(gòu)酶可以加速順反異構(gòu)過程，從而也加速有關(guān)蛋白質(zhì)的折疊。

在各種退折疊的蛋白質(zhì)中，脯氨酰異構(gòu)化是得到明確鑒定的慢反應。慢反應還可以由其他一些原因引起，比如慢的配體交換、二硫鍵連接的鏈套的重新安排等。慢反應分子和快反應分子的共存是由于退折疊態(tài)多樣性引起的折疊路徑的多樣性的最簡單例子?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★3二硫鍵引起的中間態(tài)對于在天然態(tài)中存在二硫鍵的蛋白質(zhì)來說，這些二硫鍵必須在折疊反應中通過氧化反應形成。二硫鍵生成反應需要有一個像由氧化和還原的谷胱甘肽混合物組成的那樣的氧化還原體系，以進行共價的巰基/二硫鍵交換。在體內(nèi)，真核細胞中有二硫鍵異構(gòu)酶，大腸桿菌中有DsbA和DsbC蛋白。這些琉基/二硫鍵氧化還原酶在二硫鍵生成反應中起著氧化劑的作用?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★3二硫鍵引起的中間態(tài)在牛胰蛋白酶抑制劑（BPTI）中，各二硫鍵形成的順序（路徑）和它們與構(gòu)象折疊之間的關(guān)系已經(jīng)研究得很清楚，因而以它作為例子來說明氧化折疊反應的基本特征。在有二硫鍵的蛋白質(zhì)中形成半折疊中間物的現(xiàn)象并不很普遍，在RNaseA和RnaseT1的折疊過程中就很難發(fā)現(xiàn)這樣的中間態(tài)?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★4多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊迄今為止，有關(guān)蛋白質(zhì)折疊的概念和實驗工作都是針對小的、單體的、單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的。典型地，這些蛋白質(zhì)含有100個氨基酸殘基。這些蛋白質(zhì)代表折疊的基本單元，因而也是研究折疊機理的正確選擇。更重要的是，這些蛋白質(zhì)?？梢钥赡娴卣郫B和退折疊，這是定量研究折疊熱力學和動理學的必需條件?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第六十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★4多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊但許多蛋白質(zhì)有多于一個的結(jié)構(gòu)域，也可能有多于一條的鏈。在單個結(jié)構(gòu)域或單條鏈折疊起來之后，折疊尚未完成。在折疊的某個階段，必須把這些單元裝配或結(jié)合起來，以使天然態(tài)能夠形成。

單個結(jié)構(gòu)域的折疊常常是迅速的，但結(jié)構(gòu)域間的對接或亞單元之間的結(jié)合則可能非常慢，并因此而成為折疊過程的限速步驟?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★4多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊大蛋白需要數(shù)分鐘或甚至數(shù)小時來達到天然態(tài)，而不是如小蛋白的僅需數(shù)秒或數(shù)毫秒，因而在大蛋白的折疊中會出現(xiàn)致命的問題。長壽命的未裝配的結(jié)構(gòu)域或亞單元會聚集，而不正確地配對的結(jié)構(gòu)域也會形成無功能的物質(zhì)。從這些方面考慮，大蛋白的折疊機制要比小蛋白的折疊機制更難以闡明。并且，對一種特定的大蛋白質(zhì)要找到在體外的可逆折疊條件仍是一門藝術(shù)?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日獨立的折疊結(jié)構(gòu)域最容易用量熱計鑒別。當用熱容量的變化來跟蹤熱致退折疊時，在完整的兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的熔化曲線中可以找到兩個峰。在雙結(jié)構(gòu)域的退折疊過程中有三個階段：①兩個結(jié)構(gòu)域的分離；②第一個結(jié)構(gòu)域的退折疊；③第二個結(jié)構(gòu)域的退折疊。對于大多數(shù)的雙結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，量熱曲線的第一個峰代表結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用的喪失和較不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域的退折疊；第二個峰代表較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域的退折疊。而在起穩(wěn)定作用的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用不存在時，較不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域會更不穩(wěn)定，所以當被單獨研究的時候，這個結(jié)構(gòu)域的退折疊轉(zhuǎn)變會移動到一個較低的溫度。較穩(wěn)定的那個結(jié)構(gòu)域在理想的情況下會在與完整蛋白質(zhì)相同的溫度下退折疊?！鏊?、折疊中間態(tài)第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★l接觸形成蛋白質(zhì)折疊過程中最簡單的基本過程可能就是在退折疊的多肽鏈中兩個殘基間接觸的形成。雖然這個過程很重要，但是，直到光解實驗用于細胞色素c之后才開始得到研究?！鑫?、折疊的基本過程第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日色氨酸三重態(tài)壽命測定提供了一種有用的方法來研究退折疊的或正在折疊中的蛋白質(zhì)中特定分子內(nèi)接觸的形成動理。它們也證明了這種方法可以用來解決多肽動力學性質(zhì)中的重要問題，其中最重要的是接觸形成速率與長度和組成的關(guān)系。據(jù)預測，鏈套的最可能長度約10個殘基。這些計算表明，如果肽鏈過長，因為會導致較大的熵減少，末端對末端的接觸有較低的可能性；而在較短的鏈中，由于鏈的僵硬性，末端接觸的形成也是不利的。鏈套概率的極大反映接觸形成速率的極大。在含有甘氨酸的多肽中沒有觀察到這樣的極大，主要是由于與理論計算中的一般多肽相比它們有更大的柔性。■五、折疊的基本過程第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★2螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變從20世紀80年代的后期以來，開展了大量的分離肽螺旋形成研究和理論分析。此后才有顯著數(shù)量的大小與組成與蛋白質(zhì)中相同的多肽被證明在純水溶液中為螺旋。由于具有強螺旋形成傾向，所以高丙氨酸含量的肽特別地適合于這種研究。加之這樣的多肽又容易制備，使得它們成了適用于快速動理技術(shù)研究的首選對象?！鑫濉⒄郫B的基本過程第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★2螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變有幾個重要的涉及螺旋-鏈環(huán)轉(zhuǎn)變動理的事件仍有待澄清，包括直接觀察螺旋生長的速率、探尋氨基酸取代和鏈長的動理效應。盡管可以從模型得到生長速率的估算，但通過采用時間分辨的近紅外或拉曼測量以及具有納秒時間分辨率的溫度躍變法，應該有可能直接觀察螺旋生長過程?？炕瘜W修飾來使肽鏈有一個預先存在 的螺旋核可能會使這種研究容易一些?！鑫?、折疊的基本過程第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日★3.發(fā)卡形成對片的研究并不像對螺旋的研究那樣普遍。原因是直到最近才有可能研究孤立的片。最簡單的片只含有兩條鏈段，即發(fā)卡。因為使這些發(fā)卡穩(wěn)定的疏水側(cè)鏈同時也使它們很黏糊，當濃度高到可以用核磁共振法來鑒定結(jié)構(gòu)時，孤立的發(fā)卡就傾向于聚集。實驗顯示，發(fā)卡構(gòu)象在幾個毫秒內(nèi)形成，這與丙氨酸肽的螺旋形成速率相比慢了一個數(shù)量級以上。這個發(fā)卡的熱力學和動理學行為非常類似于一個小蛋白質(zhì)?！鑫?、折疊的基本過程第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第七十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第一節(jié)蛋白質(zhì)溶液的熱力學第二節(jié)蛋白質(zhì)折疊動理學第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊二、突變與熱穩(wěn)定性疏水突變氫鍵突變適應極端條件的突變體一、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋靜電相互作用范德華相互作用氫鍵疏水效應二硫鍵第十講蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析三、突變與折疊過程過渡態(tài)的突變分析突變對穩(wěn)定性和折疊過程的影響第七十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)折疊/退折疊的平衡熱力學的和動理學的研究表明，具有生物活性的蛋白質(zhì)天然態(tài)是在熱力學平衡狀態(tài)下存在的單一構(gòu)象狀態(tài)，而失活態(tài)則是多構(gòu)象狀態(tài)。折疊態(tài)與退折疊態(tài)相比只有不顯著的，但對有機體來說是足夠而且適當?shù)姆€(wěn)定性?？偟膩砜?，一般多肽鏈的折疊/退折疊是非常復雜的過程，而且往往是不可逆的。許多單結(jié)構(gòu)域的小蛋白質(zhì)的可逆折疊/退折疊轉(zhuǎn)變成了認識一般蛋白質(zhì)折疊過程的基礎(chǔ)。這些小蛋白質(zhì)折疊表現(xiàn)出典型的兩態(tài)協(xié)同過程的特征，以單分子為協(xié)同單位，又適用于過渡態(tài)理論。第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第七十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日這種協(xié)同性是以大量的弱相互作用為基礎(chǔ)的。單獨的相互作用不足以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但許多不同殘基的協(xié)同相互作用才顯現(xiàn)出足夠的穩(wěn)定效果，并引導多肽鏈以一定的方式運動。當存在較強的相互作用，或存在較高的構(gòu)象變化的位壘，或存在除肽鏈之外的其他因素時，都會使折疊過程復雜化，如二硫鍵的存在、肽健的異構(gòu)、與輔助因子的結(jié)合都會破壞以熱運動為動力，由殘基間弱而協(xié)同的作用為導向的折疊過程。當然肽鏈本身過長也會破壞折疊的協(xié)同性?？赡芡瓿蓞f(xié)同折疊的最長肽鏈長度應該是由熱運動規(guī)律決定的。第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的性能取決于它的氨基酸序列。天然蛋白質(zhì)的序列是在進化過程中選擇出來的，以適應生物所生存的環(huán)境。當天然蛋白質(zhì)的序列發(fā)生改變時，適用于天然蛋白質(zhì)的某些結(jié)論可能就不適用于突變蛋白質(zhì)。比如，對天然蛋白質(zhì)的序列比較發(fā)現(xiàn)，當序列同源性高于一定的閾值時，不同序列的蛋白質(zhì)會折疊為非常相似，或者在粗略的眼光下看來完全相同的結(jié)構(gòu)。但是，突變實驗發(fā)現(xiàn)，即使是單位點突變，也有可能使得到的多肽鏈無法折疊為期待的單構(gòu)象狀態(tài)。除了一些特殊的情況，一般來說并不知道這是由于突變導致本來就不顯著的穩(wěn)定性完全喪失，還是由于突變產(chǎn)生的動理障礙使折疊態(tài)無法達到，甚至也不知道這樣的問題是否還有意義。第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及在溶液條件改變時天然結(jié)構(gòu)的喪失都是熱力學現(xiàn)象。在與生理條件差不多的溶液條件下，通過與水分子相互作用，在溶液中的熱運動達到熱力學平衡時，蛋白質(zhì)的構(gòu)象就穩(wěn)定在它的天然態(tài)。凡是可逆的折疊/退折疊轉(zhuǎn)變，都可以用實驗方法測定熱力學參數(shù)，包括焓變△H、熵變△S和穩(wěn)定自由能△G。但是，如何在微觀水平上用殘基-殘基或原子-原子間的相互作用去解釋這些熱力學參數(shù)，即如何從微觀的相互作用來理解蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，仍然是個有爭論的問題?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日退折疊態(tài)是多肽鏈在大量不同構(gòu)象間不停地變換的狀態(tài)，這種狀況使得蛋白質(zhì)在退折疊態(tài)有較大的構(gòu)象熵。為了使蛋白質(zhì)折疊起來，就需要通過多肽鏈各部分間相互作用所引起的內(nèi)能的減少來抵消構(gòu)象熵減少帶來的自由能增加。無論是多肽鏈各部分之間，還是多肽鏈與溶劑及溶劑與溶劑之間的相互作用都是屬于或類似于分子之間的非共價相互作用。這些相互作用可以分為幾種類型?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1靜電相互作用2范德華相互作用3氫鍵4疏水效應5二硫鍵■一、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日較新的支持疏水效應在蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性中起主要作用的證據(jù)有：①光譜和微分掃描量熱計實驗證實，折疊自由能與溫度的關(guān)系與模型化合物從水中轉(zhuǎn)移到水溶液中的轉(zhuǎn)移自由能與溫度的關(guān)系類似，兩者都包含熱容量的大量降低。②蛋白質(zhì)的大量晶體結(jié)構(gòu)證實，球蛋白結(jié)構(gòu)的主要特點是非極性殘基安排在不易與水接觸的核心部位?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日③非極性化合物在不同鹽的水溶液中有不同的溶解度。使溶解度增加的鹽的序列稱為易溶性序列。對于苯和乙酰四氨基乙?；阴?，負離子易溶性序列為SO42-、CH3COO-、C1-、Br-、ClO4-、CNS-，正離子易溶性序列為NH4+、K+、Na+、Li+、Ca2+。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受不同鹽（特別是在高鹽濃度）的影響有相同的次序，普遍地認為這是疏水相互作用的經(jīng)驗證據(jù)?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十六頁，共一百零五頁，2022年，8月28日④可及表面研究和殘基定點突變實驗證實，突變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與用于替換的氨基酸的油水分配傾向成正比。⑤蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)核心部殘基的疏水性有更強的保守性，和其他相互作用相比與結(jié)構(gòu)有更緊密的關(guān)系?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十七頁，共一百零五頁，2022年，8月28日在微觀層次上，多肽鏈的各部分之間、多肽鏈與溶劑分子之間以及溶劑分子之間的相互作用只有靜電相互作用、范德華作用及氫鍵。疏水效應是熱力學層次的現(xiàn)象。由于在大量分子的體系中分子間相互作用和熱運動的存在才使得有各種熱力學現(xiàn)象產(chǎn)生，而疏水效應正是這些熱力學現(xiàn)象之一。如果只有兩個分子，一個是極性分子，一個是非極性分子，它們之間仍然可以存在范德華相互作用，但卻不能說它們之間存在“疏水鍵”。范德華力就完全地描述了這兩個分子之間的相互作用?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十八頁，共一百零五頁，2022年，8月28日只有存在大量分子的時候，才能觀察到分子與分子之間有某種“喜好”和“憎惡”的關(guān)系。對于蛋白質(zhì)來說，當談到疏水殘基間有疏水作用時，一定隱含著其他的該形成的氫鍵都形成了，否則疏水殘基的接近不會帶來起穩(wěn)定作用的效果。所以，疏水效應是不應與靜電力、范德華力和氫鍵并列的。疏水效應正是這些微觀相互作用的熱力學后果?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第八十九頁，共一百零五頁，2022年，8月28日一些彼此能形成氫鍵的分子（極性分子）和彼此只有范德華力的分子（非極性分子）共存時，在一定的溫度下它們傾向于分相存在（疏水效應），在另一些溫度下它們可以彼此混合。這種現(xiàn)象完全取決于不同分子之間的相互作用和熱運動的規(guī)律。取決于問題本身的復雜性，有時焓可能起主導作用，有時熵可能起主導作用。所以只宜于保持疏水作用是由于分子間相互作用性質(zhì)不同所導致的熱力學現(xiàn)象的概念，至少對于蛋白質(zhì)來說，不宜于糾纏在熵（甚至是具有某些特定性質(zhì)的熵）是否起作用的問題上?！鲆?、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第九十頁，共一百零五頁，2022年，8月28日22種氨基酸側(cè)鏈在組成、大小、帶電性質(zhì)、極性、親疏水比上均不相同，通過對這些氨基酸做出的定點突變研究，根據(jù)側(cè)鏈改變之后對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，就可以了解這些物理化學性質(zhì)對穩(wěn)定性的貢獻。當?shù)鞍踪|(zhì)折疊后，81％的非極性側(cè)鏈(丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸),70％的肽鍵基團，63％的極性側(cè)鏈(門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸),54％的帶電側(cè)鏈(精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)是掩埋在分子內(nèi)部不能與水接觸的。平均起來，每個殘基可以找到1.1個分子內(nèi)有特異性的氫鍵。而在退折疊態(tài)，這些氫鍵會在分子內(nèi)或分子間不斷變化位置?！龆?、突變與熱穩(wěn)定性第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第九十一頁，共一百零五頁，2022年，8月28日1疏水突變這是一類改變疏水殘基的突變。對T4溶菌酶等若干種蛋白質(zhì)開展了這一類研究。每次改變一個疏水殘基，然后測量穩(wěn)定自由能的改變量△△G=△G(天然)△G(突變)。為了減少立體化學變化引起的張力，只考慮了由較大殘基變?yōu)檩^小殘基的突變。同樣，用甘氨酸取代的突變也不予考慮。因為這樣的突變可能會改變構(gòu)象熵對自由能的貢獻，從而影響到△△G的測量值。表4-1列出了對6種蛋白質(zhì)從異亮氨酸到纈氨酸突變后測得的△△G值?！龆?、突變與熱穩(wěn)定性第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第九十二頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第九十三頁，共一百零五頁，2022年，8月28日2氫健突變研究氫鍵突變體的目的是為了弄清一個在退折疊態(tài)與水形成氫鍵的極性基團在天然態(tài)中脫水而形成特定的分子內(nèi)氫鍵之后，使得蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增加了多少。最普遍的方法是用不能形成氫鍵的殘基（如丙氨酸）取代在天然態(tài)中形成氫鍵的殘基。在表4-2中總結(jié)了13種把天冬酰胺突變?yōu)楸彼岬慕Y(jié)果?！龆?、突變與熱穩(wěn)定性第三節(jié)突變、穩(wěn)定性和折疊第九十四頁，共一百零五頁，2022年，8月28日第九十五頁，共一百零五頁，2022年，8月28日從表4-2還可以發(fā)現(xiàn)，氫健突變的