6血紅蛋白凝膠柱層析

血紅蛋白凝膠柱層析實驗61.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)大分子的分離純化原理和方法2.學(xué)習(xí)凝膠柱層析的操作技術(shù)實驗?zāi)康膶嶒炘砩飳嶒炛薪?jīng)常對不同生物大分子進行分離純化，以便對他們作進一步的研究。對生物大分子進行分離純化的基本原理主要是利用它們之間各種理化性質(zhì)的差異，如：利用分子表面荷電狀態(tài)的不同發(fā)展成熟的電泳技術(shù)；根據(jù)不同分子對介質(zhì)吸附性不同而建立的吸附層析，疏水層析等技術(shù)；利用生物大分子特異親和的特性建立親和層析技術(shù)及生物芯片檢測技術(shù)。

凝膠層析是一種按分子大小分離物質(zhì)的層析方法，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的分離純化。該方法是把樣品加到充滿凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖夜洗脫。凝膠層析所用的基質(zhì)(凝膠)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這些物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分化合物則不能排阻，讓其在篩孔中自由擴散、滲透。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相，只能存在于凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動相和靜止相之間形成動態(tài)平衡，因此就要較長的時間流經(jīng)柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

無法載入該圖片。凝膠球可以制作成不同的孔徑，用于分離不同大小的蛋白質(zhì)。

凝膠過濾不僅常用作物質(zhì)的分離，還可以根據(jù)需要用某種試劑非常方便的處理某種物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)流經(jīng)試劑區(qū)時，因為可連續(xù)接觸新鮮試劑，因而可以充分發(fā)生反應(yīng)，最后經(jīng)過洗脫，再與過量的試劑分開。本實驗首先在層析柱中加入含有FeSO4的溶液，使形成一個還原區(qū)帶。當(dāng)血紅蛋白樣品流經(jīng)還原區(qū)帶時，還原劑FeSO4與血紅蛋白發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使血紅蛋白發(fā)生類似動脈血（氧合血紅蛋白，鮮紅）與靜脈血（還原型血紅蛋白，暗紅）之間的顏色變化，層析中可動態(tài)觀察。本實驗的待分離樣品是血紅蛋白和鐵氰化鉀的混合溶液。血紅蛋白溶液外觀顏色為紅色，而鐵氰化鉀是相對分子質(zhì)量很低的無機小分子，溶液外觀為黃色。層析過程中因鐵氰化鉀相對分子質(zhì)量小，在層析柱中呈現(xiàn)黃色帶遠(yuǎn)遠(yuǎn)落在血紅蛋白后面。材料：抗凝血（雞血，以6：1比例加入2.5%檸檬酸鈉溶液，置于4℃冰箱中保存）試劑：20mmol/L磷酸緩沖夜（pH7.0）

40mmol/LFeSO4(用時現(xiàn)配)0.2mmol/LNa2HPO480mmol/LNa2H2EDTA(用0.2mMNa2HPO4配制）藥品：固體鐵氰化鉀，葡聚糖凝（SephadexG-25）儀器及其它：層析柱10*20cm，50ml燒杯，3ml刻度滴管，濾紙片，玻璃試管實驗用品

1葡聚糖凝膠的預(yù)處理

取3g葡聚糖凝膠干粉，浸泡于50ml蒸餾水中充分溶脹（室溫，24h），然后反復(fù)傾斜去除表面懸浮顆粒，再加入pH7.0磷酸緩沖夜沸水浴中2-3h去除顆粒內(nèi)部空氣，最后加入pH7.0磷酸緩沖夜浸泡過夜備用。實驗步驟2裝柱及平衡將層析柱組裝好垂直固定在鐵架臺上。將層析柱底的出水關(guān)閉，向柱中加入約2cm高度的磷酸緩沖液，把3g(約30ml混懸液）溶脹好的凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒邊輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。自然沉降20min，裝柱高度不少于8cm，最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓型濾紙片，以保護柱床面加樣時不被沖起。加入磷酸緩沖液，保持液面3-4cm高度，每秒1/2滴流出速度洗脫平衡柱床10min。裝柱平衡上樣\進樣洗脫柱層析操作示意圖3血紅蛋白樣品制備取1ml抗凝血于小燒杯中，加入10ml20mmol/L、pH7.0的磷酸緩沖液，再加入固體鐵氰化鉀，使?jié)舛冗_(dá)到5mg/mL（全班共享）。4層析柱還原層的形成吸管取1ml40mMFeSO4于小燒杯中，加入1mL含80mmol/LNa2H2EDTA的0.2mmol/LNa2HPO4混合液攪拌均勻?？刂茖游鲋暇彌_液幾乎完全進入凝膠時，止流。速取該混合液0.4ml，小心加入層析柱中，控制流速，使混合液緩緩進入柱床，至完全；加入0.7ml緩沖液，同法操作。5上樣待柱中的磷酸緩沖液進入柱床后，止流，加入前面配制好的血紅蛋白樣品0.5ml，打開液流使樣品溶液完全流入柱內(nèi)。6洗脫滴管小心加入磷酸緩沖液進行洗脫，控制液面約4cm高度，擰緊上柱蓋，進液管置緩沖液瓶中。控制調(diào)整流速，觀察記錄色帶產(chǎn)生與變化，用潔凈玻璃試管分別收集紅色和黃色流出液，備用。7清洗待所有色帶流出層析柱，繼續(xù)用緩沖液清洗層析柱2min.用磷酸緩沖液混懸，回收凝膠。

止流，加入2cm柱高磷酸緩沖液攪拌加入溶脹好的凝膠，避免出現(xiàn)分界和不均勻。自然沉降10min，保證柱床高達(dá)8-10cm，頂端表面平整。以恒流速度1滴/2s，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min待緩沖液幾乎全部進柱，止流，加0.4mlFeSO4：EDTA-Na2緩沖液（1：1）混合液放液，待混合液進入柱床后，止流，加入0.7ml緩沖液待緩沖液進入柱床后，止流，加入0.5ml血紅蛋白樣品（沿管壁加入，以免沖起柱床），打開液流，使樣品流入柱內(nèi)。止流，加緩沖液，至液面高度達(dá)到4cm，擰緊上柱蓋，進液管置緩沖液高位槽，控制流速進行洗脫，觀察并記錄現(xiàn)象。分別收集有色流出組分，作蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定。待所有色帶流出層析柱后，緩沖液清洗柱床5min,回收凝膠檢查層析柱并垂直固定于鐵架

裝柱平衡上樣洗脫與收集注意檢查層析柱，1）保證上方進液管較長；2）下方出液管有網(wǎng)膜；3）能保障系統(tǒng)的密封狀態(tài)整個實驗中向?qū)游鲋屑尤肴魏卧噭悠范家N著管壁緩慢加入，以免將柱床表面沖起，造成不平整。整個實驗過程中不要使柱床上端液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響分離效果。蛋白質(zhì)鑒定