流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的選擇采用“HPLC”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑的過濾濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對(duì)測(cè)定的影響：1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)脫氣的目的防止由氣泡的產(chǎn)生引起的故障防止由溶解（在液體中的）氣體量的變動(dòng)引起的檢測(cè)不穩(wěn)定程度1）示差折射率檢測(cè)器*使折射率變化2）UV檢測(cè)器（200nm以下）*溶解氧氣有吸收3）熒光檢測(cè)器*溶解氧氣有消光作用脫氣的方法1.超身波脫氣法2.He清除法3.使用氟樹脂膜的減壓脫氣法梯度洗脫法梯度洗脫裝置：高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度梯度洗脫法的注意點(diǎn)溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。遵守分析周期。（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）樣品處理1.使用流動(dòng)相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)由為重要--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀選擇緩沖液的步驟1.確定最佳分離狀態(tài)時(shí)的流動(dòng)相pH2.選擇具有與流動(dòng)相的pH相近的pKa的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）3.確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)下緩沖液是否有大的吸收（在波長(zhǎng)210nm附近進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）一些代表性弱酸的pKapK1pK2pK3醋酸4.87檸檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用純水沖洗30-60min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細(xì)菌和霉菌的影響管線選擇管線選擇不銹鋼TeflonPEEK(聚醚酮)尺寸0.1mmI.D.x1.6mmO.D.0.3mmI.D.x1.6mmO.D.0.5mmI.D.x1.6mmO.D.0.8mmI.D.x1.6mmO.D管線材料不銹鋼(可用于所有連接)能承受幾千kg/cm2壓力酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕(尤其在pH小于2時(shí))PEEK(可用于所有連接)能承受高達(dá)250kg/cm2壓力可在整個(gè)PH范圍(pH1-14)內(nèi)使用不適用于高溶解性溶劑如氯仿等Teflon(用于柱后阻尼管、反應(yīng)管和排液管)化學(xué)惰性大能承受5kgf/cm2壓力液相色譜容易出問題的部件吸濾頭材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5％～20％的稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗注意點(diǎn)：吸濾頭拆下時(shí)不必將塑料管剪斷單向閥故障1：寶石球粘附于墊片表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通措施：1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負(fù)壓，使寶石球與墊片分開2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗故障2：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大措施：拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗柱塞密封圈故障：密封圈磨損而導(dǎo)致密封不良現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大或漏夜措施：更換密封圈注意點(diǎn)：更換密封圈拆卸泵頭前，柱塞桿復(fù)位（P－SET）線路過濾器故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大或壓力偏高措施：5％稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力>3kgf/cm2，則可能堵塞。進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：1）全量注入2）部分注入手動(dòng)進(jìn)樣法便捷的方法（不需清洗）1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器2.切到裝填狀態(tài)3.注入樣品4.切回到進(jìn)樣狀態(tài)手動(dòng)進(jìn)樣器操作注意點(diǎn)：1）插針應(yīng)插到底2）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針3）清洗應(yīng)使用專用針口清洗器手動(dòng)進(jìn)樣閥故障：轉(zhuǎn)子密封損壞現(xiàn)象：漏液原因：a擰的太緊b樣品太臟c針頭損壞或不使用液相專用針解決措施：更換轉(zhuǎn)子密封，并在使用手動(dòng)進(jìn)樣閥故障：載樣困難原因：a定量環(huán)堵塞b進(jìn)樣器污染解決措施：清洗或更換定量環(huán)、進(jìn)樣器分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測(cè)穩(wěn)定性柱子故障：系統(tǒng)高壓、峰型變差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留時(shí)間的改變解決措施：清洗正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇反相柱