實驗微生物大小及數(shù)量測定

實驗微生物大小及數(shù)量測定第1頁/共21頁CentralLaboratoryofBiology實驗五微生物大小及數(shù)量測定微生物學(xué)實驗第2頁/共21頁課前提問與目的要求【課前提問】1.顯微測微尺測量微生物大小的原理是什么？2.測定過程中應(yīng)注意哪些問題？【目的要求】1.學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測微尺測定微生物大小的方法。2.掌握對不同形態(tài)細菌細胞大小測定的分類學(xué)基本要求，增強對微生物細胞大小的感性認識。第3頁/共21頁【基本原理】微生物細胞的大小是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。其測量工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻標準刻尺的載玻片，其尺度總長為1mm，精確分為10個大格，每個大格又分為10個小格，共100小格，每一小格長度為0.01mm，即10μm。圖5-1鏡臺測微尺中央部分及鏡臺測微尺校正目鏡測微尺第4頁/共21頁目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微放大后的細胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實際長度也不一樣?！净驹怼康?頁/共21頁【實驗用品】1.菌種：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和迂回螺菌的染色玻片標本。2.試劑：香柏油，二甲苯。3.儀器和其他用品：鏡臺測微尺，目鏡測微尺，普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙等。第6頁/共21頁【方法步驟】目鏡測微尺的安裝校正目鏡測微尺菌體大小的測定測定完畢第7頁/共21頁1）使用鏡臺測微尺進行校正時，若一時無法直接找到測微尺，可先對刻尺外的圓圈線進行準焦后再通過移動標本推進器進行尋找。2）細菌個體微小，在進行細胞大小測定時一般應(yīng)盡量使用油鏡，以減少誤差。3）細菌在不同的生長時期細胞大小有時會有較大變化，若需自己制樣進行細菌細胞大小測定時，應(yīng)注意選擇處于對數(shù)生長期的菌體細胞材料。獲得本實驗成功的關(guān)鍵第8頁/共21頁【注意事項】1.目鏡測微尺很輕、很薄，在取放時應(yīng)特別注意防止使其跌落而損壞。2.觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺測微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時，務(wù)必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺測微尺和損壞鏡頭。第9頁/共21頁【實驗報告】1.結(jié)果1）將目鏡測微尺校正結(jié)果填入表5-1中表5-1目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度/μm低倍鏡高倍鏡油鏡目鏡放大倍數(shù)：

第10頁/共21頁2）將各菌測定結(jié)果記錄填入表5-2中。12345678910平均值(μm)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌迂回螺旋菌注：球菌用直徑（寬度）表示細胞大小，桿菌和螺菌用寬度×長度表示細胞大小。表5-2金黃色葡萄球菌大小測定記錄【實驗報告】第11頁/共21頁3）用表5-3對各菌測定結(jié)果進行計算和表述。細菌名稱目鏡測微尺每格代表的長度/μm寬長目鏡測微尺平均格數(shù)寬度μm目鏡測微尺平均格數(shù)長度μm菌體大小金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌迂回螺菌注：球菌用直徑（寬度）表示細胞大小，桿菌和螺菌用寬度×長度表示細胞大小?！緦嶒瀳蟾妗康?2頁/共21頁2.思考題

1）為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？

2）在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細菌的大小時，其測定結(jié)果是否相同？為什么？【實驗報告】第13頁/共21頁第二部分顯微鏡直接計數(shù)法測定微生物數(shù)量【課前提問】1.血球計數(shù)板的基本原理是什么？2.顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)缺點是什么？【目的要求】1.明確顯微鏡計數(shù)的原理；2.學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。第14頁/共21頁【基本原理】血細胞計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構(gòu)成3個平臺。中間較寬的平臺又被一段橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分9個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16小方格（圖5-2）；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為1mm，則每一個大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3（10-4mL）。

第15頁/共21頁以25個中方格的計數(shù)板為例，設(shè)5個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則：×25×104×B1mL菌液中的總菌數(shù)=

圖5-2血球計數(shù)板側(cè)面及兩種類型的計數(shù)室【基本原理】第16頁/共21頁圖5-2血球計數(shù)板第17頁/共21頁【實驗用品】菌種：酵母菌懸液。儀器及其他：普通光學(xué)顯微鏡，血細胞計數(shù)板，蓋玻片，擦鏡紙，酒精燈，無菌毛細管，三角燒瓶?！痉椒ú襟E】菌懸液制備檢查血球計數(shù)板加樣品顯微鏡計數(shù)清洗第18頁/共21頁獲得本實驗成功的關(guān)鍵1）活細胞是透明的，因此在進行顯微計數(shù)時應(yīng)適當(dāng)減低視野亮度，以增大反差。2）進行顯微計數(shù)時應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計數(shù)。【注意事項】1）使用酒精燈時注意不要被火焰灼傷或燒到衣物。2）取放過微生物培養(yǎng)物的接種環(huán)在放回試驗臺前應(yīng)記得再次在火焰上灼燒滅菌，以免造成實驗臺污染。3）用接種環(huán)在培養(yǎng)基斜面上刮取時動作要輕，不要將瓊脂培養(yǎng)基一起刮起。第19頁/共21頁【實驗報告】1.結(jié)果：表5-4顯微計數(shù)結(jié)果各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/mL12345第一