抗腫瘤藥物篩選方法

抗腫瘤藥物篩選張冬梅第一頁(yè)，共105頁(yè)。一、導(dǎo)論二、整體動(dòng)物水平的篩選三、細(xì)胞水平的篩選四、酶水平的篩選五、展望第二頁(yè)，共105頁(yè)。一、導(dǎo)論

1.腫瘤發(fā)病率和死亡率全球每年癌癥新發(fā)病例都在1200萬(wàn)以上，因癌癥死亡人數(shù)達(dá)760多萬(wàn)，到2010年底全球腫瘤病人總數(shù)已逾5500萬(wàn)人(WHO)。心臟病腦血管病腫瘤25%消化系統(tǒng)病肺病其他第三頁(yè)，共105頁(yè)。中國(guó)每年新增腫瘤病人200萬(wàn)人，死亡130-170多萬(wàn)人左右，目前全國(guó)腫瘤患者總數(shù)約450萬(wàn)人，并以每年3%的速度遞增。腫瘤已經(jīng)成為中國(guó)公民的頭號(hào)殺手，每年因惡性腫瘤而死亡的人口占到總死亡率的22%。2009年中國(guó)居民主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成

死亡原因死亡率(1/10萬(wàn))占總死亡人數(shù)百分率惡性腫瘤13522%腦血管病11120%心臟病9618%呼吸系統(tǒng)病7215%損傷和中毒315%消化系統(tǒng)病175%糖尿病171%(中國(guó)衛(wèi)生年鑒)第四頁(yè)，共105頁(yè)。２００9年中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤的死亡率

我國(guó)居民常見(jiàn)癌癥死亡率:

胃癌列腫瘤死亡率首位;其次肝癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等。第五頁(yè)，共105頁(yè)。2.腫瘤的治療方法外科手術(shù)治療放射線治療化學(xué)藥物治療第六頁(yè)，共105頁(yè)。3.常用的化療藥物烷化劑

環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺抗代謝藥物

甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷抗腫瘤抗生素

柔紅霉素、阿霉素、絲裂霉素、多柔比星鉑類化合物

順鉑、卡鉑、奧沙利鉑抗腫瘤植物藥

長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇激素類

血管新生抑制劑

貝伐珠單抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼

第七頁(yè)，共105頁(yè)?；熕幬锏闹饕涣挤磻?yīng)骨髓抑制（血細(xì)胞減少）胃腸道反應(yīng)（惡心、嘔吐、食欲不振等）全身反應(yīng)（脫發(fā)、發(fā)熱、皮疹）對(duì)各器官影響

（心臟毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性）泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性腎?。┚植快o脈炎致畸、致突變、致癌第八頁(yè)，共105頁(yè)。4.天然產(chǎn)物與抗腫瘤藥物

天然產(chǎn)物在新藥及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用，是結(jié)構(gòu)新穎和作用獨(dú)特的抗腫瘤化合物的重要來(lái)源。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）從1955年開(kāi)始從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤藥物。目前世界上被批準(zhǔn)廣泛使用的抗腫瘤藥物中,５０％以上來(lái)源于天然產(chǎn)物。第九頁(yè)，共105頁(yè)。二、整體動(dòng)物水平的篩選

１．非實(shí)體瘤動(dòng)物模型腫瘤名稱代號(hào)宿主腫瘤名稱代號(hào)宿主艾氏腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病L1210DBA小鼠白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病P615615小鼠常用小鼠腹水瘤動(dòng)物模型表（細(xì)胞株及動(dòng)物）國(guó)內(nèi)外推薦模型第十頁(yè)，共105頁(yè)。

腫瘤移植方法：1）無(wú)菌操作2）接種部位：腹腔3）癌細(xì)胞懸液的制備及接種

接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，穿過(guò)腹部肌肉吸取腹水2~4mL*，置冰塊上保存。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，PBS稀釋制備1x107/0.1mL細(xì)胞濃度懸液，每只小鼠注射0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液注射到腹腔。5天左右，小鼠出現(xiàn)腹水即為造模成功。

*腹水應(yīng)為白色濃稠液體，若為黃色或紅色應(yīng)棄去第十一頁(yè)，共105頁(yè)。給藥及藥效評(píng)價(jià)：動(dòng)物分組：隨機(jī)分五組（溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、高、中、低給藥組）；每組8-10只。藥品制備：藥品溶解生理鹽水或PBS等緩沖鹽溶液給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上評(píng)價(jià)指標(biāo)：觀察記錄荷瘤小鼠的存活天數(shù)（30天）

（7天死亡率≥20%或20%動(dòng)物存活超過(guò)4周，實(shí)驗(yàn)失敗

對(duì)照組存活時(shí)間14-20天）數(shù)據(jù)處理：生命延長(zhǎng)率(%)＝治療組存活天數(shù)－對(duì)照組存活天數(shù)對(duì)照組存活天數(shù)

非腹腔給藥生命延長(zhǎng)率>50%腹腔給藥>75%x100%第十二頁(yè)，共105頁(yè)。２.實(shí)體瘤動(dòng)物模型1）動(dòng)物移植性腫瘤

腫瘤名稱代號(hào)宿主腫瘤名稱代號(hào)宿主艾氏癌實(shí)體型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌實(shí)體型HepSKM小鼠BALB/c小鼠黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠結(jié)腸癌C26BALB/c小鼠瓦克癌肉瘤W256Wistar大鼠結(jié)腸癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠實(shí)體瘤動(dòng)物模型表（細(xì)胞株及動(dòng)物）國(guó)內(nèi)外推薦模型第十三頁(yè)，共105頁(yè)。

腫瘤移植方法：

1）無(wú)菌操作2）接種部位：右前肢腋下

3）癌塊的制備及接種

接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，切開(kāi)皮膚取出腫瘤塊，置于生理鹽水中，冰塊上保存。剪碎瘤塊成2-3mm3的小塊或組織塊勻漿成細(xì)胞懸液，接種到右前肢腋下。5天左右，小鼠出現(xiàn)瘤塊即為造模成功。

7天后對(duì)照組20%小鼠腫瘤小于400mg或大于2g，實(shí)驗(yàn)失敗第十四頁(yè)，共105頁(yè)。給藥及藥效評(píng)價(jià)：給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。12天后，處死小

鼠，撥瘤稱重（對(duì)照組瘤重1g左右）。

取脾臟和胸腺稱重，并測(cè)定脾細(xì)胞數(shù)目數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝對(duì)照組瘤重－治療組瘤重對(duì)照組瘤重

抑瘤率>30%認(rèn)為有效x100%第十五頁(yè)，共105頁(yè)。２）人癌異種移植模型

細(xì)胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞

動(dòng)物：

裸鼠（nudemice）

特點(diǎn)：

1）裸體，行似無(wú)毛；

2）不能執(zhí)行正常T細(xì)胞功能，免疫力低下

3）B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活性高T淋巴功能缺陷先天性無(wú)胸腺小鼠11號(hào)染色體上隱性

突變裸基因（nu）

第十六頁(yè)，共105頁(yè)。

腫瘤移植和給藥方法：

1）無(wú)菌操作2）接種部位：背部

3）細(xì)胞懸液的制備及接種

細(xì)胞懸液濃度1x108/mL，接種0.1mL到背部。7天左右，瘤塊達(dá)到50mm3體積即為造模成功，開(kāi)始給藥。

4）給藥時(shí)間：根據(jù)藥效確定，一般12-60天。

第十七頁(yè)，共105頁(yè)。陽(yáng)性藥

5-Fu（5-氟尿嘧啶）

ADM（阿霉素）

Taxol（紫杉醇）

CTX（環(huán)磷酰胺）選擇性對(duì)照藥推薦劑量：1-20mg/kg給藥方式：與測(cè)試藥物相同;常隔天給藥第十八頁(yè)，共105頁(yè)。藥效評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。結(jié)束治療后，處死小鼠，撥瘤稱重（對(duì)照組瘤重1g左

右）。取脾臟稱重，并測(cè)定脾細(xì)

胞數(shù)目。數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝對(duì)照組腫瘤體積－治療組腫瘤體積對(duì)照組腫瘤體積

抑瘤率>30%認(rèn)為有效x100%第十九頁(yè)，共105頁(yè)。抗腫瘤譜

Taxol

（卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、食管癌、淋巴瘤）5-Fu

（乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌和頭頸部腫瘤）

ADM

（乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮膚癌）第二十頁(yè)，共105頁(yè)。沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤作用(Carcinogenesis,2013,34:1331)第二十一頁(yè)，共105頁(yè)。三、細(xì)胞水平的篩選1.抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)2.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)3.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)4.抗腫瘤血管生成實(shí)驗(yàn)5.腫瘤多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)6.抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)7.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)第二十二頁(yè)，共105頁(yè)。細(xì)胞株的選擇第二十三頁(yè)，共105頁(yè)。１.抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)A)噻唑蘭實(shí)驗(yàn)（MTT）

原理：

活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的MTT，生成藍(lán)紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570

nm

處進(jìn)行測(cè)定。甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。

第二十四頁(yè)，共105頁(yè)。MTT原理示意圖甲臜生成量正比于活細(xì)胞數(shù)采用比色法（570nm）測(cè)定甲臜生成量第二十五頁(yè)，共105頁(yè)。實(shí)驗(yàn)方法1）細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液：RPMI1640、DMEM、MEM、M199、McCoy’s5A等

血清：

FBS、NBS、

抗生素：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、新生霉素等

胰酶：

Trypsin-EDTA、Collagenase

緩沖液：

PBS、HBSS等

生長(zhǎng)因子：EGF、B-27、N-2等第二十六頁(yè)，共105頁(yè)。2）細(xì)胞傳代

貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3min后，離心，調(diào)節(jié)適當(dāng)密度重新懸浮在培養(yǎng)液中。3）細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)板第二十七頁(yè)，共105頁(yè)。5）細(xì)胞接種

3000-10000細(xì)胞接種在96孔板，貼壁24小時(shí)，或?qū)?shù)生長(zhǎng)期6）加藥處理72h（指定時(shí)間點(diǎn)）7）MTT溶液（5mg/ml），孵育2-4小時(shí)8）棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶解生成的

甲臜9）酶標(biāo)儀測(cè)定OD值

第二十八頁(yè)，共105頁(yè)。結(jié)果處理：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)）OD對(duì)照X100%根據(jù)生長(zhǎng)抑制的量效曲線求出IC50

值腫瘤細(xì)胞存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)OD對(duì)照X100%第二十九頁(yè)，共105頁(yè)。AB問(wèn)題：根據(jù)上圖中細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，

判斷化合物A和B哪一個(gè)具有較好的

腫瘤生長(zhǎng)抑制作用？

第三十頁(yè)，共105頁(yè)。Ｂ）磺酰羅丹明B（SRB）實(shí)驗(yàn)

原理：

SRB是粉紅色的氨基甲氧雜蒽類化合物，是蛋白結(jié)合染料，與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合后呈粉紅色，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。細(xì)胞中的蛋白含量與吸光度成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目和活性。第三十一頁(yè)，共105頁(yè)。方法：類似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定1h

后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30min，洗去

染料，空氣干燥后，加入10mMTris溶解

后，5４0nm測(cè)定光密度結(jié)果處理：同ＭＴＴ法第三十二頁(yè)，共105頁(yè)。Ｃ）細(xì)胞排染法（酞酚藍(lán)）

原理：

細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性被破壞，正常細(xì)胞排染，而死亡細(xì)胞染成藍(lán)色。

伊紅、苯胺黑等染料第三十三頁(yè)，共105頁(yè)。細(xì)胞死亡率（%）對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)－給藥組活細(xì)胞數(shù)對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)X100%=結(jié)果：方法：

細(xì)胞懸液加入酞酚藍(lán)染色液混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞數(shù)目（藍(lán)色）第三十四頁(yè)，共105頁(yè)。２.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

NBT還原法原理：硝基藍(lán)四氮唑蘭(NBT)還原法測(cè)定細(xì)胞株分化誘導(dǎo)。正常的中性粒細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖支路活躍,細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶含量增加,將可溶性NBT還原為不溶性藍(lán)紫色顆粒,而沉積于細(xì)胞漿內(nèi)。方法：HL-60細(xì)胞株是篩選分化誘導(dǎo)劑的,藥物作用后,細(xì)胞形態(tài)向粒細(xì)胞方向分化。結(jié)果：顯微鏡計(jì)數(shù)NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算誘導(dǎo)分化率第三十五頁(yè)，共105頁(yè)。對(duì)照組藥物處理組第三十六頁(yè)，共105頁(yè)。３.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)Ａ）形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡）原理：細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察方法：藥物處理后，收集細(xì)胞，4%戊二醛固定2h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片做成銅網(wǎng)，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。第三十七頁(yè)，共105頁(yè)。對(duì)照組凋亡細(xì)胞正常細(xì)胞胞質(zhì)散在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜清楚、染色質(zhì)均勻、核仁明顯。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現(xiàn)。對(duì)照組第三十八頁(yè)，共105頁(yè)。壞死線粒體腫脹

凋亡細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹。壞死細(xì)胞細(xì)胞膜不完整，核膜破裂，染色質(zhì)呈蟲(chóng)蝕狀溶解。第三十九頁(yè)，共105頁(yè)。B）DNA形態(tài)觀察（Hoeschst333258）原理：Hoeschst333258與DNA特異性結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光方法：腫瘤細(xì)胞用Hoeschst333258染色后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果：活細(xì)胞成均勻的淡熒光，調(diào)亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)強(qiáng)熒光的顆粒狀物質(zhì)。第四十頁(yè)，共105頁(yè)。對(duì)照組藥物處理組第四十一頁(yè)，共105頁(yè)。C）染色體ＤＮＡ斷裂測(cè)定原理：凋亡細(xì)胞內(nèi)源性核酸酶激活，ＤＮＡ鏈被切割成200bp不同倍數(shù)的片段，將這些片斷進(jìn)行電泳，可觀察到ＤＮＡ梯帶方法：裂解腫瘤細(xì)胞，消化蛋白，提?。模危?，上凝膠電泳，ＥＢ染色后，ＵＶ燈下觀察。結(jié)果：凋亡細(xì)胞顯示ＤＮＡ梯帶。第四十二頁(yè)，共105頁(yè)。

CTLDRUG1DRUG2

MARKER第四十三頁(yè)，共105頁(yè)。３）PI/Annexin-Ｖ-FITC雙染色分析

原理：調(diào)亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細(xì)胞表面，PS結(jié)合標(biāo)記熒光素FITC的Annexin-V但細(xì)胞膜仍然完整，熒光染料ＰＩ不能進(jìn)入，而調(diào)亡晚期的細(xì)胞可同時(shí)受Annexin-V

和PI的雙標(biāo)記。

方法：腫瘤細(xì)胞同時(shí)加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，用流式細(xì)胞儀分析。第四十四頁(yè)，共105頁(yè)。正常細(xì)胞Annexin-V(-)PI(-)晚期凋亡細(xì)胞Annexin-V(+)PI(+)早期凋亡細(xì)胞Annexin-V(+)PI(-)Annexin-VPI第四十五頁(yè)，共105頁(yè)。PI/AnnexinV-FITC雙染激光共聚焦分析結(jié)果PI紅色熒光細(xì)胞核AnnexinV-FITC綠色熒光細(xì)胞膜第四十六頁(yè)，共105頁(yè)。Annexin-V-FITCPI對(duì)照組藥物處理組第四十七頁(yè)，共105頁(yè)。４.抗腫瘤血管生成實(shí)驗(yàn)

腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤直徑超過(guò)2mm時(shí),直接由微環(huán)境提供的營(yíng)養(yǎng)就不能滿足其生長(zhǎng)需要,此時(shí)腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新生血管運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成,阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在治療腫瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。第四十八頁(yè)，共105頁(yè)。１）血管內(nèi)皮細(xì)胞體外篩選模型原理：體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在含生長(zhǎng)因子條件下能形成細(xì)胞條索，然后形成管狀。腫瘤血管生成抑制劑能抑制細(xì)胞管腔的形成。方法：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在含有藥物和不含有TAI

藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后,在顯微鏡下比較

它們形成的管腔數(shù)目。

對(duì)照組藥物處理組第四十九頁(yè)，共105頁(yè)。２）雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型

原理：雞卵在胚胎發(fā)育過(guò)程中，尿囊膜上的血管生長(zhǎng)很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜上的血管生長(zhǎng)。方法：雞胚胎放在直培養(yǎng)皿內(nèi),在無(wú)菌恒溫箱中孵育到第9天的生長(zhǎng)高峰時(shí),將浸泡過(guò)藥物的明膠海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)２天，在顯微鏡下隨機(jī)取幾個(gè)視野點(diǎn),記數(shù)“熱點(diǎn)”區(qū)的新生血管數(shù),計(jì)算平均值。第五十頁(yè)，共105頁(yè)。血管生成抑制率（%）對(duì)照組血管面積－給藥組血管面積對(duì)照組血管面積X100%＝結(jié)果：CTL低劑量藥物高劑量藥物組第五十一頁(yè)，共105頁(yè)。３）斑馬魚(yú)血管新生模型

斑馬魚(yú)被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選抗血管生成藥物。

其胚胎早期發(fā)育的過(guò)程中,血管生成的模式比較簡(jiǎn)單,主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間,體節(jié)間的血管最初由背部的動(dòng)脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。斑馬魚(yú)胚胎第五十二頁(yè)，共105頁(yè)。方法：在96孔板上用藥物處理胚胎,通過(guò)血管內(nèi)源性堿性磷酸酶染色來(lái)顯示血管,進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物對(duì)血管生成的作用。結(jié)果：

第五十三頁(yè)，共105頁(yè)。第五十四頁(yè)，共105頁(yè)。５耐藥性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)

腫瘤細(xì)胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因mdr1編碼表達(dá)P-糖蛋白（P-gp）是產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。P-gp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度。

１）腫瘤耐藥性體外模型的建立

逐步增加腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（Dox）誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥株。用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)敏感株和耐藥株的細(xì)胞毒性，同時(shí)測(cè)定mdr1基因和P-gp表達(dá)水平。第五十五頁(yè)，共105頁(yè)。耐藥株敏感株P(guān)-gp敏感株耐藥株第五十六頁(yè)，共105頁(yè)。2)逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選方法：采用MTT法測(cè)定加逆轉(zhuǎn)劑前后DOX對(duì)耐藥株的細(xì)胞毒性。計(jì)算逆轉(zhuǎn)效果.FR(逆轉(zhuǎn)倍數(shù))=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/IC50(加逆轉(zhuǎn)劑）IC50(耐藥性肝癌細(xì)胞株R-HepG2)FRDox160uMDox+Vep31uM5第五十七頁(yè)，共105頁(yè)。EffectofNSC23925toreversedrugresisitanceinMDRcelllines第五十八頁(yè)，共105頁(yè)。第五十九頁(yè)，共105頁(yè)。

用熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)加藥前后耐藥細(xì)胞株內(nèi)抗癌藥多柔比星Dox的含量。Control0.5uMDox+1uMVep0.5uMDox0.5uMDox+5uMVep0.5uMDox+10uMVep第六十頁(yè)，共105頁(yè)。HepG/ADMControlVerapamil5mMDrug1.25mMDrug2.5mMDrug5mM多柔比星累積實(shí)驗(yàn)第六十一頁(yè)，共105頁(yè)。Rhm123累積實(shí)驗(yàn)ControlVerapamil5mMDrug1.25mMDrug2.5mMDrug5mM第六十二頁(yè)，共105頁(yè)。6.抗腫瘤侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征腫瘤的遷移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過(guò)程，Liotta等提出腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的三步學(xué)說(shuō)，即粘附、降解和移動(dòng)。粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲的起始，腫瘤細(xì)胞通過(guò)表面特定受體與基底膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原等相粘連，然后在蛋白水解酶和相關(guān)因子的作用下，侵襲基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)腫瘤細(xì)胞一旦突破基底膜，逃避免疫監(jiān)視，即在基質(zhì)內(nèi)較快侵襲性生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移。阻斷其中任何一個(gè)過(guò)程，都可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲第六十三頁(yè)，共105頁(yè)。１）粘附實(shí)驗(yàn)原理：將Matrigel鋪在96孔板上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以有效地在體外模擬腫瘤細(xì)胞的粘附過(guò)程。方法：將Matrigel包被96孔板，過(guò)夜，將藥物處理后的細(xì)胞接種在96孔板，1h后，棄去未粘附的細(xì)胞，加入MTT培養(yǎng)，測(cè)定吸光度。

結(jié)果：細(xì)胞粘附

抑制率（%）=（OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn)）OD對(duì)照X100%第六十四頁(yè)，共105頁(yè)。2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)）方法：細(xì)胞按30000個(gè)/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到90%融合度，用20uL移液器槍頭在每孔劃出十字形劃痕，PBS清洗后，加入藥物處理后（無(wú)血清培養(yǎng)基），顯微鏡下觀察拍照。第六十五頁(yè)，共105頁(yè)。ABCDEA:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)第六十六頁(yè)，共105頁(yè)。Transwell技術(shù)3）細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)第六十七頁(yè)，共105頁(yè)。原理：腫瘤細(xì)胞在趨化因子的作用下可穿透聚碳酸酯膜，從上室轉(zhuǎn)移到下室，有些藥物可抑制這種遷移。方法：

（1）Transwell小室的制備Matrix包被并水化基底膜（2）制備細(xì)胞懸液1~10x105的細(xì)胞/200uL（3）細(xì)胞接種

下室20%FBS的培養(yǎng)液，上室無(wú)血清培養(yǎng)液（4）細(xì)胞培養(yǎng)24-48h（5）細(xì)胞染色，拍照并計(jì)數(shù)第六十八頁(yè)，共105頁(yè)。A:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)第六十九頁(yè)，共105頁(yè)。細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)A:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1第七十頁(yè)，共105頁(yè)。6.自噬實(shí)驗(yàn)自噬：是以細(xì)胞器的自我消化和更新為特征生化過(guò)程過(guò)程：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。生物功能：一般認(rèn)為自噬是保護(hù)細(xì)胞，但是也可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。第七十一頁(yè)，共105頁(yè)。自噬過(guò)程第七十二頁(yè)，共105頁(yè)。自噬的特征第七十三頁(yè)，共105頁(yè)。自噬的檢測(cè)MDC法

原理：自噬小泡呈偏酸性，綠色的ＭＤＣ熒光染料能選擇性聚集方法：加入ＭＤＣ（３ｍＭ）處理15min后，激光共聚焦顯微鏡觀察第七十四頁(yè)，共105頁(yè)。LC3-GFP原理：LC3-GFP綠色熒光蛋白克隆細(xì)胞株，出現(xiàn)自噬時(shí)伴隨LC3高表達(dá)，呈現(xiàn)綠色熒光染料方法：

藥物處理預(yù)定時(shí)間后，激光共聚焦顯微鏡觀察第七十五頁(yè)，共105頁(yè)。相關(guān)蛋白表達(dá)LC3Atg5Beclin1p62第七十六頁(yè)，共105頁(yè)。四、酶水平的篩選ＤＮＡ拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑篩選

端粒酶酶抑制劑篩選VEGFR酪氨酸蛋白激酶酶抑制劑篩選

組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選法基尼轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選絲裂原活化蛋白激酶抑制劑篩選第七十七頁(yè)，共105頁(yè)。ＤＮＡ拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑篩選

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種重要的核酶，通過(guò)DNA鏈斷裂和重接而改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)其空間構(gòu)型變化，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用第七十八頁(yè)，共105頁(yè)。方法：裂解細(xì)胞,提取拓?fù)洚悩?gòu)酶,測(cè)定酶總量或酶活

性的變化,在酶反應(yīng)體系中，加入負(fù)超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA,TOPO酶提液及不同濃度的藥

物，溫育30min后，加入反應(yīng)終止液，在瓊脂糖

凝膠中電泳,溴化乙錠染色紫外燈下觀察。結(jié)果：第七十九頁(yè)，共105頁(yè)。端粒酶抑制劑篩選

端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu),起著保護(hù)染色體的完整和穩(wěn)定性的作用,端粒酶是一種核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶,可以自身RNA為模板合成端粒末端。正常細(xì)胞端粒酶活性是陰性,而在腫瘤細(xì)胞株表達(dá)高活性。第八十頁(yè)，共105頁(yè)。方法：裂解細(xì)胞，提取蛋白，測(cè)定蛋白含量，ＰＣＲ擴(kuò)增，凝膠電泳，銀染色結(jié)果：端粒是由短DNA重復(fù)序列組成,而端粒酶的作

用是維持端粒末端的長(zhǎng)度,因此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

間接反映端粒酶活性。第八十一頁(yè)，共105頁(yè)。藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的影響第八十二頁(yè)，共105頁(yè)。VEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑篩選

VEGFR受體酪氨酸蛋白激酶能特異性地將磷酸根轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗性密切相關(guān)。

以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)成為國(guó)際上抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。第八十三頁(yè)，共105頁(yè)。受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)示意圖第八十四頁(yè)，共105頁(yè)。腫瘤相關(guān)的受體酪氨酸激酶第八十五頁(yè)，共105頁(yè)。ELISA方法：

以96孔酶標(biāo)板作為實(shí)驗(yàn)容器,加入包被液谷氨酸酪氨酸多聚多肽，孵育過(guò)夜。加入受試物和酪氨酸激酶反應(yīng)1h后，加入辣根過(guò)氧化物

酶標(biāo)記的小鼠抗磷酸化酪

氨酸單克隆抗體,室溫反應(yīng)30min后,用酶標(biāo)儀讀

取吸光度(OD)值。

第八十六頁(yè)，共105頁(yè)。QandAODODODInhibitionrate(%)Blank0.0140.0150.013CTL(1UTrk)0.5740.5820.5980.5uMVA(1UTrk)0.4350.4120.4061uMVA(1UTrk)0.2560.2130.2455uMVA(1UTrk)0.1020.0980.123

試求出不同濃度ＮＡ對(duì)酪氨酸蛋白激酶的抑制率第八十七頁(yè)，共105頁(yè)。組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選

組蛋白是核小體的重要組成部分，組蛋白的乙?；?，DNA構(gòu)象易于展開(kāi)，核小體的結(jié)構(gòu)松弛，利于轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄活化因子與DNA的接觸，激活基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

第八十八頁(yè)，共105頁(yè)。

組蛋白乙酰化酶（HAC）和去乙?；福℉DAC）的協(xié)同調(diào)節(jié)作用決定了組蛋白和部分非組蛋白的乙?；剑翘囟ɑ虮磉_(dá)的切換開(kāi)關(guān)。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑可通過(guò)組蛋白和非組蛋白的乙?；?，阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑某些蛋白的活化，而發(fā)揮抗腫瘤活性。第八十九頁(yè)，共105頁(yè)。原理：含乙?；嚢彼岬亩屉谋籋DAC區(qū)去乙酰

化后，發(fā)出熒光（353nm和448nm）.Boc-(Ac)Lys-AMC+HDAC→Boc-Lys-AMC

無(wú)熒光熒光

方法：在96孔板中依次加入反應(yīng)緩沖液、短肽

底物、HDAC酶以及不同濃度的抑制

劑，37℃孵育30-60min，加入顯色液

終止反應(yīng)，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度第九十頁(yè)，共105頁(yè)。TrichostatinA抑制HDAC酶活性第九十一頁(yè)，共105頁(yè)。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）為膠原酶，是一種金屬離子依賴的蛋白酶，可有效降解基底膜的主要成分膠原及明膠，它的異常表達(dá)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì),參與血管形成、炎癥、腫瘤的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等。

第九十二頁(yè)，共105頁(yè)。

原理：熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）FRET肽段底物經(jīng)MMPs酶催化斷裂，EDAN片段發(fā)出熒光（340/490nm）第九十三頁(yè)，共105頁(yè)。方法：在96孔或84孔板中依次加入反應(yīng)緩沖

液、FRET肽底物、MMP酶及抑制劑混

勻，5-60min內(nèi)連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)組設(shè)置:

陽(yáng)性對(duì)照組（含MMP酶）

抑制劑組（含MMP酶和抑制劑）

溶劑對(duì)照組（含MMP酶和測(cè)試溶劑）

底物對(duì)照組（僅有底物）

測(cè)試藥物組（含MMP酶和測(cè)試藥物）第九十四頁(yè)，共105頁(yè)。法尼基轉(zhuǎn)移酶（Ras）抑制劑篩選

Ras蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)通路的重要元件,是控制外來(lái)分子信號(hào)的分子開(kāi)關(guān)。Ras蛋白以GDP結(jié)合和GTP結(jié)合兩種形式存在。第九十五頁(yè)，共105頁(yè)。原理：

(pulldownassay)

活化形式的GTP-Ras與下游的效應(yīng)蛋白