在乳酸培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)乳酸脫氫酶進(jìn)行乙偶姻合成研究

PAGE1在乳酸培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)乳酸脫氫酶進(jìn)行乙偶姻合成研究摘要乳酸是一種價格低廉且來源廣泛、易得、無污染的化合物，它在生物化學(xué)過程中起著很重要的作用；純品為無色液體，工業(yè)品為無色到淺黃色液體。無氣味，具有吸濕性。能與水、乙醇、甘油混溶，水溶液呈酸性，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。因其具有特殊的理化性質(zhì)及功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品業(yè)、農(nóng)業(yè)蓄業(yè)及其他工業(yè)等等。在生物化學(xué)反應(yīng)中，乳酸在乳酸脫氫酶的作用下能轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下生產(chǎn)α-乙酰乳酸及二氧化碳，乙酰乳酸經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧作用合成乙偶姻。乙偶姻，是一種重要的香料物質(zhì)，又名3-羥基-2-丁酮或甲基乙酰甲醇，在自然界中存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中，其具有令人愉快的奶油香味,多用于奶油、干酪、咖啡、果實的香味增強劑，還用于配置奶油、乳品、酸奶和草莓型等香精；還可以改變啤酒的風(fēng)味，并能決定黃油及奶油發(fā)酵制奶酪過程中的香味；乙偶姻也是一種重要的四碳平臺化合物,在食品、醫(yī)藥、煙草、化妝品、化工等行業(yè)具有廣泛的用途,還可用于合成高附加值手性藥物、化學(xué)中間體、液晶材料。目前乙偶姻的生產(chǎn)方法有酶轉(zhuǎn)化法、化學(xué)合成法，以及微生物法。人們的生活水平日漸提高，對生活要求也越來越高，人們利用乙偶姻的需求也逐漸增大，其利用價值也越來越大；因此提升乙偶姻的產(chǎn)量是目前人們比較緊迫的事情之一。大腸桿菌是一種原核生物，其種類很多；雖含有致病性種類，但由于大腸桿菌易培養(yǎng)，成本低，且基因表達(dá)能水平高，表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，故能將其作為基因工程大腸桿菌。基因工程技術(shù)是蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ)，它使從基因水平上改造微生物蛋白質(zhì)成為了可能，而基因工程技術(shù)的第一步就是基因的克隆，基因克隆是指將目的基因從生物體的組織、器官或細(xì)胞中分離，將其與載體的DNA連接，使DNA重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。本論文的實驗?zāi)康脑谟谘芯縟ld基因重組工程大腸桿菌是否能在以乳酸為碳源的培養(yǎng)條件下正常生長；并在此條件下能否產(chǎn)乙偶姻以及提高乙偶姻的合成量。關(guān)鍵詞：乳酸；乳酸脫氫酶；基因工程大腸桿菌；dld基因；乙偶姻

ABSTRACTLacticacidisakindofcheap,widelyavailable,pollution-freecompound,whichplaysanimportantroleinbiochemistry.Pureproductsforcolorlessliquid,industrialproductsforcolorlesstolightyellowliquid.Odourlessandhygroscopic.Canbemisciblewithwater,ethanol,glycerol,watersolutionisacidic,insolubleinchloroform,carbondisulfideandpetroleumether.Becauseofitsspecialphysicalandchemicalpropertiesandfunctions,itiswidelyusedinfood,medicine,cosmetics,agriculture,storageandotherindustries.Inbiochemicalreactions,lacticacidcanbeconvertedtopyruvateundertheactionoflactatedehydrogenase.Pyruvateproducesα-acetolacticacidandcarbondioxideundertheactionofα-acetolacticacidsynthase.Acetoinissynthesizedbydecarboxylationofacetolacticacidbyα-acetolacticaciddecarboxylase.Acetin,isanimportantflavorsubstance,alsoknownas3-hydroxy-2-butanoneormethylacetylmethanol,existsinnatureincorn,grapes,cocoa,apples,bananas,cheese,meatandmanyotherfoods,ithasapleasantcreamflavor,usedincream,cheese,coffee,fruitflavorenhancer,Alsousedintheconfigurationofcream,dairy,yogurtandstrawberryflavor;Itcanalsochangetheflavorofbeer,anddeterminetheflavorofbutterandcreaminthefermentationprocessofcheese;Acetoinisalsoanimportantfour-carbonplatformcompound,whichhasawiderangeofapplicationsinfood,medicine,tobacco,cosmetics,chemicalindustries,andcanalsobeusedinthesynthesisofhighvalue-addedchiraldrugs,chemicalintermediates,liquidcrystalmaterials.Atpresent,acetoinisproducedbyenzymaticconversion,chemicalsynthesis,andmicrobialmethods.People'slivingstandardisimprovingdaybyday,andthedemandforlifeisgettinghigherandhigher.People'sdemandforusingacetoinisalsoincreasinggradually,anditsusevalueisalsogettingbiggerandbigger.Therefore,theproductionofacetoinwasincreasedEscherichiacoliisaprokaryoticorganismwithmanyspecies.Althoughitcontainspathogenicspecies,EscherichiacolicanbeusedasgeneticengineeringEscherichiacolibecauseofitseasyculture,lowcost,highlevelofgeneexpressionandmatureandperfectexpressionsystem.Geneticengineeringtechnologyisthebasisofproteinengineering,whichmakesitpossibletomodifymicrobialproteinsatthegenelevel.Thefirststepofgeneticengineeringtechnologyisgenecloning.Genecloningmeanstoseparatethetargetgenefromthetissue,organorcelloftheorganismandconnectitwiththeDNAofthecarrier.AtechniqueinwhichrecombinantDNAmoleculesareintroducedintorecipientcellsforreplicationandamplification.Geneticengineeringtechnologyprovidesapowerfulmeanstostudythestructureandfunctionofgenes.ThepurposeofthispaperistostudywhethertheDldgenerecombinantEscherichiacolicangrownormallyunderthecultureconditionoflacticacidascarbonsource.Undertheseconditions,whetheracetoincanbeproducedandthesynthesisofacetoincanbeincreased.Keywords:lacticacid,Lactatedehydrogenase,GeneticallyengineeredEscherichiacoli,Dldclutchesgenes,Bbenzoin

目錄TOC\o"1-2"\h\u14811摘要 421365ABSTRACT 552721.緒論 9178021.1乙偶姻的簡介 9151231.1.1乙偶姻的性質(zhì) 9207441.1.2乙偶姻的用途 9154681.1.3乙偶姻的生理作用 9326821.1.4乙偶姻的生產(chǎn) 10159011.2乙偶姻的合成代謝途徑 11248121.3乳酸脫氫酶 12148451.4基因工程大腸桿菌 1257621.4.1基因工程菌簡介 1213381.4.2基因工程大腸桿菌種類 13148271.4.3基因工程大腸桿菌 14123491.5本論文的研究意義及研究內(nèi)容 1428872.材料與方法 1537362.1實驗材料 1571812.1.1引物 15285182.1.2質(zhì)粒 15318402.1.3菌株 1645632.2試劑與試劑盒 16266362.2.1試劑名稱 16324092.2.2試劑盒 1762632.3儀器 17303952.4培養(yǎng)基與緩沖液 18192082.4.1培養(yǎng)基 18268212.4.2緩沖液 18183842.5主要試劑配方 19105842.6實驗方法 20211162.6.1細(xì)菌DNA提取 20206832.6.2PCR擴(kuò)增 21327292.6.3凝膠電泳 22284592.6.4酶切 23318572.6.5質(zhì)粒提取 2343202.6.6T4連接 24299552.6.7熱激轉(zhuǎn)化 2586312.6.8菌落PCR及菌種保藏 2661292.6.9基因測序 26269302.6.10乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 2678892.6.11生長曲線測定 27292482.6.12乙偶姻含量測定 2724953.結(jié)果與分析 294623.1基因序列分析 29169423.2質(zhì)粒載體構(gòu)建 2968673.2.1質(zhì)粒載體構(gòu)建 29187573.2.2構(gòu)建載體質(zhì)粒 29173453.3乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)濃度 29302123.4生長速率測定 3083263.4.1空載體與PAcYc-Dld-Duet重組菌的生長曲線 30107023.4.2空載體與PAcYcDuet-1-AlsS-AlsD-Dld重組菌的生長曲線 32198373.5產(chǎn)乙偶姻速率測定 33220264.結(jié)論 352817參考文獻(xiàn) 3617397符號說明 錯誤！未定義書簽。1663附錄 錯誤！未定義書簽。

1.緒論1.1乙偶姻的簡介1.1.1乙偶姻的性質(zhì)乙偶姻（CAS：513-86-0），化學(xué)品名3-羥基-2-丁酮（3-Hydroxy-2-butanone），又名3-羥基丁酮（3-Hydroxybutan-2-one）或甲基乙酰甲醇（Methylacetylcarbinol），分子式C4H8O2,分子量88.12，有兩個手性異構(gòu)體。化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖：3-羥基-2-丁酮單體為無色或淡黃色液體，呈奶油香氣，兩分子3-羥基-2-丁酮易聚合成二聚體，二聚體為白色結(jié)晶粉末，熔點15℃，沸點148℃，能自燃，易溶于水、乙醇、丙二醇，微溶于乙醚，在植物油中幾乎不溶。1.1.2乙偶姻的用途乙偶姻是一種微黃色液體，具有獨特令人愉快的奶油香及脂香，在自然界中存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中。商業(yè)中多用于奶油、干酪、咖啡、果實的香味增強劑，還用于配置奶油、乳品、酸奶和草莓型等香精；乙偶姻還可以改變啤酒的風(fēng)味，并能決定黃油及奶油發(fā)酵制奶酪過程中的香味。乙偶姻不止在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，它是一種重要的四碳平臺化合物,由于其具有較好的生物相溶性及溶解度、是最簡單的偶姻，能作為許多化合物的前體，可用于合成高附加值手性藥物、化學(xué)中間體、液晶材料，因此乙偶姻在醫(yī)藥、煙草、化妝品、化工等行業(yè)也具有廣泛的用途。1.1.3乙偶姻的生理作用微生物中的生物學(xué)功能：①維持pH穩(wěn)定：在富含糖類的培養(yǎng)基中，細(xì)菌能將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻或2，3-丁二醇（2，3-butanediol，BD），而2，3-丁二醇的積累可抗衡丙酮酸和乙酸等酸性產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而維持pH平衡，避免菌體早亡。②作為貯存能源：當(dāng)可葡萄糖等碳源物質(zhì)被細(xì)胞利用完以后，2，3-丁二醇被轉(zhuǎn)化為乙偶姻，乙偶姻可作為新的代替碳源或能源。③維持NAD+/NADH的平衡：乙偶姻和支鏈氨基酸（2，3-丁二醇）之間的相互轉(zhuǎn)化是和NAD+與NADH之間的相互轉(zhuǎn)化相偶姻的，故而乙偶姻/支鏈氨基酸代謝途徑也能夠作為維持細(xì)菌體內(nèi)NAD+/NADH平衡的策略[1]。在高等植物和昆蟲中的化學(xué)信息功能：乙偶姻和2，3-丁二醇的分泌能力很弱或完全廢除。由于其溫和的揮發(fā)能力、特有的氣味及化學(xué)結(jié)構(gòu)，乙偶姻作為化學(xué)信息素具有較大的潛能，尤其是在某些昆蟲、花及水果中。植物細(xì)胞能夠生產(chǎn)乙偶姻，與其他有氣味的組分一起，是植物富含芳香，吸引昆蟲及高等動物幫助它們授粉、育種及繁殖。從反面來說，利用這一點可以對害蟲進(jìn)行防治。高度動物中的生理學(xué)功能：乙偶姻是大家眾所周知的發(fā)酵產(chǎn)物，但卻很少有人知道這一點，乙偶姻使人體汗液中第三豐富的揮發(fā)性化合物（Meijerinketal，2000）。另外，乙偶姻也存在攝入酒精后的正常男性的血液及尿液中。乙偶姻作為關(guān)鍵代謝物可解釋哺乳動物中對乙醛的解毒機制。在病理學(xué)條件下，乙偶姻在哺乳類系統(tǒng)中調(diào)節(jié)中間代謝機制有作用。而在高等生物中潛在的乙偶姻合成機制仍未知[2]。1.1.4乙偶姻的生產(chǎn)乙偶姻目前的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成及生物合成法。其中化學(xué)合成法主要有2，3-丁二酮選擇還原法，2-3-丁二醇選擇氧化法以及乙醛催化偶聯(lián)法；而生物和合成法主要是酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。2，3-丁二酮選擇還原法：以2，3-丁二酮作為原料，添加催化劑和還原劑來加氫還原得到3-羥基丁酮即乙偶姻。此方法因成本低，反應(yīng)步驟溫和，設(shè)備需求低，不需要特定的催化劑，在工業(yè)中應(yīng)用廣泛。但此方法分離純化乙偶姻困難，且副產(chǎn)物多。2，3-丁二醇選擇性氧化法：利用此法生產(chǎn)合成乙偶姻，目前主要集中于探索空氣氧化法和電化學(xué)氧化法?？諝庋趸丛谘b填酮刨花的反應(yīng)器中，將2，3-丁二醇與空氣加熱至315℃后通過管式反應(yīng)器被空氣氧化得到乙偶姻。電化學(xué)氧化法反應(yīng)即通過電解，使2，3-丁二醇失去H質(zhì)子后變成負(fù)離子，向正極遷移從而被氧化，氧化劑在負(fù)極得到電子被還原，此法只需要使反應(yīng)溫度維持在40℃，電池電壓為0.8V即可實現(xiàn)反應(yīng)。電解氧化相比空氣氧化法，產(chǎn)率更高、產(chǎn)品純度更好、易分離提取、工藝簡單、操作費用低、三廢更少，且不使用催化劑。但實現(xiàn)連續(xù)操作還比較困難，規(guī)模生產(chǎn)還有許多問題尚未解決。以上兩種化學(xué)合成方法的原料（2，3-丁二酮，2，3-丁二醇）來源均來自石油，隨著是有的日益枯竭，這兩種原料的成本將越來越高，必將增加乙偶姻的生產(chǎn)成本，更加不能滿足人們對乙偶姻的消費需求，因此需要迫切的找到一條可持續(xù)生產(chǎn)乙偶姻的生產(chǎn)工藝[3]。乙醛催化偶聯(lián)法：以乙醛為原料，在三唑鎓內(nèi)鎓鹽或噻唑鎓內(nèi)鎓鹽的催化作用下通過縮合反應(yīng)生成乙偶姻。具有成本低、設(shè)備需求少、副產(chǎn)物少、高產(chǎn)量、純化及分離簡單等優(yōu)點，因而在工業(yè)生產(chǎn)中用途越來越廣泛。乙醛催化偶聯(lián)法符合“原子經(jīng)濟(jì)性”的特征，產(chǎn)率高，生產(chǎn)過程簡單，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。而乙醛催化偶聯(lián)法是在自生壓反應(yīng)釜中進(jìn)行，無需溶劑，降低了對環(huán)境的污染。但缺點是：催化劑制備過程復(fù)雜，在制備其催化劑噻唑鹽的過程中，需要在具有毒性的乙腈溶劑中回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后回收乙腈，給整個工藝過程帶來了毒性和危險性。除此之外，乙醛的沸點低，易揮發(fā)易燃難以運輸及儲存，操作中易遺失，造成環(huán)境污染，危及安全。雖然用三聚乙醛能夠解決上述問題，但使用三聚乙醛會增加反應(yīng)的復(fù)雜性并降低乙偶姻的產(chǎn)量。由于化工合成法工藝路線存在缺點，且產(chǎn)品質(zhì)量令人擔(dān)憂，因而對生物合成法的期望越來越高。生物合成法主要有兩種方法：一種是酶轉(zhuǎn)化法，用從乳酸菌和酵母菌中分離純化出的丁二酮還原酶，催化2，3-丁二醇或丁二酮從而得到乙偶姻。該方法轉(zhuǎn)化率高，沒有副產(chǎn)物，但問題在于要獲得純的特異性的酶較為困難，且原料與化學(xué)法相同，都受到來源限制。二是微生物發(fā)酵法，目前研究發(fā)現(xiàn)表明，自然界中存在某些具有產(chǎn)乙偶姻能力的細(xì)菌，以糖質(zhì)為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，但發(fā)酵過程中乙偶姻通常是作為2，3-丁二醇和丁二酮的副產(chǎn)物而出現(xiàn)的，且產(chǎn)量較少。雖說產(chǎn)量較少，但目前已經(jīng)有不少研究學(xué)者們從自然界中分離出了，能夠高產(chǎn)乙偶姻的枯草芽胞桿菌SFA-H31（CGMCC1869）能夠有效地轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻。該方法相比之前面幾種方法，其原料為廉價的生物質(zhì)，且微生物發(fā)酵由于反應(yīng)過程溫和且對環(huán)境影小，不僅客服原料的缺陷也獲得了高生產(chǎn)力，故而此方法成為乙偶姻生產(chǎn)中最具競爭力的方法。1.2乙偶姻的合成代謝途徑參與乙偶姻合成代謝的酶主要有三個，包括a-乙酰乳酸合成酶(

α-

acetolactatesynthase，ALS），α-乙酰乳酸脫羧酶（α-acetolactate

decarboxylase,，ALDC）及2，3-丁二醇脫氫酶（2，3-butanediol

dehydrogenase,

BDH），也稱乙偶姻還原酶(acetoinreductase，AR)。ALS是焦磷酸硫胺素（Thiamine

pyrophosphate,

TPP）依賴的，需要二價金屬離子使其正常工作，如Mg2+。真核生物或古生菌中未發(fā)現(xiàn)ALDC。ALS可將兩分子的丙酮酸轉(zhuǎn)化為一分子的α-乙酰乳酸（α-acetolactate,，AL），α-乙酰乳酸不穩(wěn)定，經(jīng)過ALDC作用生成乙偶姻或通過非酶氧化脫羧生成雙乙酰（Phalip

et

al1994；

Zuljan

et

al，

2014），雙乙酰也可通過BDH化為乙偶姻，該酶也可將乙偶姻轉(zhuǎn)化為2，3-

丁二醇（Rattray

et

al，2000）。另外，在某些菌中，乙偶姻也可通過丙酮酸與乙醛的直接碳連接來進(jìn)行合成，催化反應(yīng)的酶可以是丙酮酸氧化酶（pyruvate

oxidase，POX）、丙酮酸脫羧酶（pyruvate

decarboxylase,，PDC）或丙酮酸脫氫酶（pyruvate

dehydrogenase，

PDH）（Xiao

&

Lu,

2014a）。例如：2，3-丁二醇在脫氫酶的作用下失去H+，合成乙偶姻的途徑如下圖所示：1.3乳酸脫氫酶乳酸是自然界中最重要的一種2-羥基酸，在微生物的許多生物工程中發(fā)揮重要作用(Exleyetal,2007；Garvie，1980)。原核生物及真核生物均可利用乳酸(Jiangetal，2014)。通過乳酸利用可使得某些微生物生存，但某些微生物利用乳酸也會引起致病性（Exleyetal，2005；Smithetal，2007）。L-乳酸脫氫酶(L-lactatedehydrogenase，L-LDH)是微生物中L-乳酸代謝中的關(guān)鍵酶，它可分為NAD依賴的(NAD-dependent

L-lactate

dehydrogenases，L-nLDHs)和NAD非依賴的L-乳酸脫氫酶（NAD-independentL-lactatedehydrogenases，L-iLDHs)（Garvie,1980）[4]。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下能轉(zhuǎn)化成丙酮酸，丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下生產(chǎn)α-乙酰乳酸及二氧化碳，乙酰乳酸經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧作用合成乙偶姻。1.4基因工程大腸桿菌1.4.1基因工程菌簡介基因工程菌，是指將目的基因?qū)爰?xì)菌體內(nèi)使其表達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白的細(xì)菌。如大腸桿菌?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA分子，然后再將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除DNA重組技術(shù)外，基因工程還包括基因的表達(dá)技術(shù)、基因的突變技術(shù)、基因的導(dǎo)入技術(shù)等?；蚬こ叹鷳?yīng)具備以下條件：①發(fā)酵產(chǎn)品具有高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率；②菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵；③菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素；④代謝控制容易進(jìn)行；⑤能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定。大腸桿菌是基因工程主要原核受體菌。1.4.2基因工程大腸桿菌種類1、大腸桿菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存質(zhì)粒，但該菌株的蛋白酶沒有缺陷，表達(dá)的蛋白容易被降解，因此通常不作為表達(dá)菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α-互補?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株?；蛐停篎-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1大腸桿菌BL21(DE3)菌株該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白?；蛐停篎-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾目的蛋白的表達(dá)。該菌適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白?；蛐停篎-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr4、大腸桿菌JM109菌株該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α-互補，從而顯示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大腸桿菌TOP10菌株該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳?；蛐停篎-，mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG6、大腸桿菌HB101菌株該菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各種基因重組實驗?；蛐停簊upE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-17、XL10-Gold菌株：所制備的感受態(tài)細(xì)胞是目前轉(zhuǎn)化效率最高的感受態(tài)細(xì)胞，缺失幾乎所有已知的限制酶切系統(tǒng)；同時缺失核酸內(nèi)切酶（endA），提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型（recA）減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性，提高感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率及大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化能力的宿主菌基因型[5]。1.4.3基因工程大腸桿菌（1）大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢：①全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；②基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；③繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；④被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢：①缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；②缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；③內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；④細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動子、終止子、核糖體結(jié)合位點、密碼子、質(zhì)粒拷貝數(shù)。啟動子是DNA上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能與起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)最關(guān)鍵調(diào)控元件（沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）[6]。1.5本論文的研究意義及研究內(nèi)容1.5.1研究意義乙偶姻是一種重要的化合中間體，它具有獨特的奶油香氣，能作為一些食物的香味增強劑；不僅如此乙偶姻在香料、化妝、農(nóng)業(yè)等行業(yè)都具有非常重要的用途。隨著人們的生活水平日漸提高，對生活要求也越來越高，人們利用乙偶姻的需求也逐漸增大，其利用價值也越來越大；因此提升乙偶姻的產(chǎn)量是目前人們比較緊迫的事情之一。1.5.2研究內(nèi)容目前實驗室發(fā)現(xiàn)一株貝萊斯枯草芽孢桿菌禪乙偶姻的含量達(dá)26.5%，實驗室該菌株中提取了dld基因，即乳酸脫氫酶表達(dá)基因。本論文研究重組大腸桿菌在基因dld的表達(dá)下在以乳酸為碳源的條件下產(chǎn)乙偶姻的含量。

2.材料與方法2.1實驗材料2.1.1引物本研究中使用的引物名稱與序列如下表所示：表2-1-1本研究使用的引物PrimernamePrimersequence（5’to3’）dld-FggaattccatatgATGTCTTCCATGACAACAACTGdld-RggGGTACCTTACTCCACTTCCTGCCAGAlsSR-LapGTCGCTTGCGTTTTTCATCAGAGCTTTAGCTTTCATTTTTTCAlsDF-LapGAAAAAATGAAAGCTAAAGCTCTGATGAAAAACGCAAGCGACAlsSF2CGCggatccGATGGCTAAAGCTACCAACGAACTG

AlsDR2CgagctcTTATTCCGGGCTTCCTTCGGTTGT注：下劃線部分為酶切位點2.1.2質(zhì)粒本研究所使用的質(zhì)粒主要為實驗室的保存質(zhì)粒以及本人在研究過程中所構(gòu)建的部分質(zhì)粒，具體內(nèi)容如下表所示：表2-1-2本研究使用的質(zhì)粒Duet-up2TTGTACACGGCCGCATAATCDuet-down1GATTATGCGGCCGTGTACAAT7-termGCTAGTTATTGCTCAGCGGpACYCDuet-up1GGATCTCGACGCTCTCCCT2.1.3菌株本研究所用菌株均為實驗室保存菌株，以及以此為基礎(chǔ)在本研究過程中構(gòu)建的菌株，具體菌株如下表示：表2-1-3本研究使用的菌株StrainsRelevantgenotypeorcharatceristicsSourcesE.coliStrainsBL21(DE3)ompThsdSB(rB-mB-)(DE3)LabcollectionDH5αφSOdlacZ△M15endAIrecAIhsdR17(rK-，mK-)Labcollection2.2試劑與試劑盒2.2.1試劑名稱主要藥品藥品名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家硫酸銨AR重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠檸檬酸，一水AR重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠檸檬酸鈉AR重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠KH2PO4AR成都科隆化工試劑廠KClAR成都科隆化工試劑廠NaClAR成都科隆化工試劑廠FeSO4·7H2OAR成都科隆化工試劑廠硫酸鎂，七水AR成都科隆化工試劑廠乳酸鈉AR成都科隆化工試劑廠1-萘酚AR成都科隆化工試劑廠肌酸AR成都科隆化工試劑廠冰乙酸AR成都科隆化工試劑廠氯化鎂AR成都科隆化工試劑廠氯化銨AR成都科隆化工試劑廠咪唑AR杭州百思生物技術(shù)有限公司NaOHAR杭州百思生物技術(shù)有限公司硼酸AR杭州百思生物技術(shù)有限公司甜菜堿AR杭州百思生物技術(shù)有限公司牛肉浸粉BR杭州百思生物技術(shù)有限公司蛋白胨BR杭州百思生物技術(shù)有限公司酵母浸粉BR杭州百思生物技術(shù)有限公司瓊脂粉BR成都市科隆化學(xué)品有限公司瓊脂糖BR成都科隆化工試劑廠葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、蒸餾水、溶菌酶、蝸牛酶、TAE溶液、Tris-HCl、SDS、Tris-HCl、EDTA等均為國藥試劑2.2.2試劑盒細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒；2.3儀器主要儀器儀器型號生產(chǎn)廠家手提式高壓蒸汽滅菌鍋DSX-24L-1上海申安醫(yī)療器械廠低速離心機TD-5Z上海醫(yī)療器械有限公司恒溫鼓風(fēng)干燥箱CMD-20X上?，樮帉嶒炘O(shè)備有限公司全自動雪花制冰機IMS-30上?，樮帉嶒炘O(shè)備有限公司高速冷凍離心機?上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生化培養(yǎng)箱BSP-400上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠隔水式恒溫培養(yǎng)箱GSP-9080MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠可見分光光度計V-1000上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠智城超凈工作臺ZHJH-C118C上海智城分析儀器制造有限公司電泳儀DYY-6D上海精密科學(xué)儀器有限公司藍(lán)光觀察儀WD-940X上海精密科學(xué)儀器有限公司pH測定儀?上海精密科學(xué)儀器有限公司恒溫水浴鍋?上海翱藝儀器有限公司微波爐A390型上海翱藝儀器有限公司Thermo超微量紫外分光光度計ND-ONE-W北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司基因擴(kuò)增儀ETC811杭州博日科技股份有限公司全溫震蕩器HZQ-2常州市儀都儀器有限公司優(yōu)普系列超純水機UPT-I-20T四川優(yōu)普超純科技有限公司其他所需材料100mL量筒，酒精燈，各種量程的燒杯，玻璃棒，250mL錐形瓶，250mL擋板三角瓶，酒精噴霧，各種量程的槍頭，移液槍，pH試紙，1.5mL離心管，15mL離心管，接種環(huán)，涂布器，平板，封口膜，橡皮筋，記號筆，口罩，橡膠手套，比色皿，等等。2.4培養(yǎng)基與緩沖液2.4.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，用蒸餾水定容至1000mL；LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1000mL；121℃高壓蒸汽滅菌25min?？剐裕篊M（濃度），IPTG（1mM）。SOC培養(yǎng)基（100mL）：2%胰化蛋白胨2.0g，酵母提取物0.5g，1mL1MNaCl，0.25mL1MKCl，1mL2MMgCl，2mL1M葡萄糖溶液。新鮮培養(yǎng)基：乳酸培養(yǎng)基：KH2PO42.5g，（NH4）2SO43g，KCl1.86g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.08g，MgSO4·7H2O0.24g，檸檬酸一水1.00g，檸檬酸鈉1.00g，牛肉浸粉2g，甜菜堿（4℃）1g，乳酸鈉8.2g，蒸餾水定容至1000mL；調(diào)pH7.0；121℃滅菌25min。2.4.2緩沖液緩沖液5×TBE緩沖液（1L）：Tris54g，硼酸27.5g，EDTA10mM（pH8.0），使用時稀釋10倍。50×TAE緩沖液（1L）：Tris242g；冰乙酸57.1mL，EDTA50mM（pH8.0），使用時稀釋50倍。BindingBuffer（1L）：20mMNa2HPO4，0.5mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4。ElutionBuffer（1L）：20mMNa2HPO4，0.5mMNaCl，500mM咪唑，pH7.4。2.5主要試劑配方（1）0.1

M

甘油

CaCl2：取一定量無水氯化鈣和75

mL甘油，加水定容至

500

mL，高溫濕熱滅菌，121

℃，20

min。（2）0.1

M

MgCl2：水溶后定容到500

mL，高溫濕熱滅菌，121

℃，20

min。（3）0.1

M

CaCl2：水溶后定容到500

mL

高溫濕熱滅菌，121

℃，20

min。（4）solutionA(GTE緩沖溶液)：1%

葡萄糖；25

mM

Tris-HCl；50

mM

EDTA，pH值

8.0。取2

g葡萄糖，5

mL1

M

Tris-HCl(pH8.0)，10

mL

EDTA(pH8.0)，水溶后定容到200

mL。（5）1mol/L

IPTG溶液：稱取2.38

g異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，定容到10

mL；（6）50

mg/mL卡那霉素（Km）：0.05

g卡那霉素加水溶解然后定容到10

mL，進(jìn)行過濾除菌（0.22

μm濾膜），分裝到潔凈的1.5

mL的離心管內(nèi)，放入-20

℃冰箱冷藏，記作Km。（7）（100

μg/mL）AMP（氨芐青霉素）：取1

mL氨芐青霉素液體，加水定容到10

mL，然后1

mL/管分裝，-20

℃保存?zhèn)溆?。?）3M

NaAc(PH5.2)：在800

mL水中溶解408.1

g三水乙酸鈉，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至5.2，加水定容至1

L，分裝后高壓蒸汽滅菌。（9）10%

SDS（十二烷基磺酸鈉）：溶解100

g

SDS在900

mL水中，加熱至68℃以溶解SDS結(jié)晶，加水至1L體積，分裝并室溫保存。（10）1

M

Tris-HCl：溶解121.14

g三羥甲基氨基甲烷至800

mL水中，使用滴加濃鹽酸的方法調(diào)節(jié)溶液的PH值，PH

8.0，需要42

mL，再加水定容至1L，高壓滅菌后室溫保存。（11）蛋白酶K（20

mg/mL）：稱取0.02

g蛋白酶于水中，定容至10

mL，1

mL/管分裝，-20

℃保存?zhèn)溆?。?2）蝸牛酶（100

mg/mL）：稱取0.1

g蝸牛酶于水中，定容至10

mL，1

mL/管分裝，-20

℃保存?zhèn)溆?。?3）溶菌酶（100

mg/mL）：稱取0.1

g溶菌酶于水中，定容至10

mL，1

mL/管分裝，-20

℃保存?zhèn)溆?。?4）100

mMCaCl2：稱取2.22g無水氯化鈣，加水定容到200

mL，單獨裝入在藍(lán)口瓶里滅菌。2.6實驗方法2.6.1細(xì)菌DNA提取DNA提取是生物學(xué)領(lǐng)域最基礎(chǔ)的操作，是科研和生產(chǎn)中常用的方法。目前

DNA

提取分離的常見方法，一般是用

CTAB、SDS

等緩沖液裂解細(xì)胞，而后通過酚氯仿抽提蛋白質(zhì)，再用乙醇沉淀的方法來抽提

DNA。首先將乳酸菌按照

10%的接種量進(jìn)行液體培養(yǎng)，于

37℃搖床培養(yǎng)

24

h，然后按照以下步驟具體操作提取細(xì)菌

DNA，最后用

Thermo

超微量紫外分光光度計對其進(jìn)行

dsDNA

測定。（1）向

5

mL

LB液體培養(yǎng)基中接種貝萊斯枯草芽孢桿菌，震動培養(yǎng)過夜，取

0.5

mL

菌液轉(zhuǎn)移至

1.5

mL

離心管，5000

rpm離心

5

min，去除上清液，收集菌體；（2）加入

0.5

mL

雙蒸水，充分懸浮，5000

rpm

離心

5

min，盡量去除上清液；

（3）用

0.5

mLsolutionA

懸浮細(xì)胞，加入微量溶菌酶；（4）加

10

μL

溶菌酶（終濃度

100

mg/mL），震蕩混勻，55℃水浴

10

min；（5）加入

10

μL

蝸牛酶（終濃度

100

mg/mL），震蕩混勻

30

s，置于

37℃水浴

30

min；（6）加

20

μL

蛋白酶

K(20

mg/mL)，震蕩混勻；（7）加入

25

μL10%SDS，震蕩混勻；（8）60℃水浴

1

小時，溶液變清，加入

250

μL

雙蒸水；（9）加入

250

μL苯酚顛倒混勻（吸取上清液），加入

250

μL

氯仿；（10）充分混勻，13000

rmp

離心

2

min，取上清液，移至新離心管中；（11）重復(fù)(9)(10)1-2

次；（12）加

500

μL

氯仿顛倒混勻，13000

rpm

離心

1

min；（13）將上清液（約

500

μL）轉(zhuǎn)移至新離心管中，加

50

μL3MNaAc(pH5.2)和500

μL

異丙醇，混勻，零下

20℃放置

20

min，出現(xiàn)

DNA

絮狀沉淀。12000

rpm

離心

5

min；（14）去除上清液，用

500

μL75%乙醇洗滌

DNA

兩次（12000

rpm

離心

2

min），盡量除去液體，晾干酒精；（15）用

100

μLTE

溶解（提前

60℃預(yù)熱）DNA[7]。2.6.2PCR擴(kuò)增（1）配制PCR反應(yīng)體系，成分如下表所示：成分用量10×PCRBuffer5μLdNTPmix（10mM）1μL引物1（5μM）1μL引物2（5μM）1μLDNA聚合酶（2U/μL）1μLDNA模板1μL無菌水加至50μL注：1.如果DNA模板中G+C含量較高，可以在反應(yīng)體系中添加5%的甘油和5%的DMSO；2.DNA模板濃度不需要嚴(yán)格定量，根據(jù)不同需要，模板使用量有所不同，菌落PCR中可以直接挑取少量菌體作為DNA模板。（2）設(shè)定反應(yīng)程序（如表），對目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增；（3）PCR反應(yīng)進(jìn)行完成后，取5μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有適合大小的DNA片段的特異擴(kuò)增，則手機剩余產(chǎn)物，進(jìn)行后續(xù)實驗。步驟溫度時間預(yù)變性變性退火延伸循環(huán)充分延伸保存結(jié)束95℃94℃Tm72℃30℃72℃25℃4min45sec45secXminTimes5min1minEnd注：退火溫度一般為引物Tm值?5°C，Taq酶延伸時間為1min/kb，pfu酶延伸時間為2min/kb[8]。PCR產(chǎn)物純化：使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，按如下操作步驟進(jìn)行分離純化：在PCR反應(yīng)體系中加入5倍體積的Buffer

B3充分混勻；8000

×g離心30

s,棄掉收集管中液體；加入500

μL

Wash

Solution

9000

×g離心30

s，棄掉收集管中液體；重復(fù)步驟3，1-2次；空柱9000

×g，離心1

min；將吸附柱套上一個干凈的1.5

mL離心管，在吸附膜中央加入15-40

μL

Elution

Buffer（提前60

℃烘箱預(yù)熱），室溫靜置1min后

，離心12000

rpm，1

min；-20

℃，保存管中DNA溶液，備用。2.6.3凝膠電泳（1）清洗并安裝好制膠槽，并插入所需要的梳子型號；（2）稱取1.2g瓊脂糖凝膠，加入140mL1×TAE緩沖液，放入微波驢加熱溶解（短時多次溶解），直至瓊脂糖凝膠完全溶化；（3）用自來水冷卻瓊脂糖凝膠溶液，冷卻至50℃左右（不燙手），加入4μLGoldView顯色液，搖勻，將溶液倒入制膠槽內(nèi)，室溫下靜置使其冷卻凝固（30min左右）；（4）凝膠凝固后垂直向上拔出梳子。連同制膠板一同取出凝膠，清理制膠板和制膠槽內(nèi)的碎的凝膠，并將凝膠放入電泳槽內(nèi)；（5）用移液器吸取載樣緩沖液于點樣板小孔中，混合5-6μL10×loadingBuffer和50μLDNA樣品，加入點樣孔；空白：在另一點樣孔中加入10μL標(biāo)準(zhǔn)分子量（DL2000）DNAMarker；（6）調(diào)節(jié)電壓至100-120V，直至色帶調(diào)條到達(dá)凝膠2/3-3/4處斷電；（7）將凝膠至于紫外透射檢測儀上，觀察查并拍照記錄[9]。切膠回收：瓊脂糖凝膠電泳目的基因，紫外燈下切除目的基因的瓊脂糖，用紙巾吸盡凝膠表面的液體，盡量減少不含目的基因的凝膠量，稱重（100mg=300μL）；盡量切碎凝膠；向離心管中加入3倍體積的BufferB2溶液，50℃水浴加熱，使凝膠完全融化（5-10min）；（選做）<500bp加入1/3BufferB2體積的異丙醇；將溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中8000×g離心30s，倒掉收集管中的液體；加入500μLWashSolution溶液，9000×g離心30s，倒掉收集管中液體，重復(fù)步驟5一次；孔吸附柱于9000×g離心1min；吸附柱放入干凈的1.5mL離心管，在吸附膜中央加入30μLElutionBuffer，室溫靜置1min，9000×g離心1min，保存管中DNA溶液。2.6.4酶切（1）配置DNA的酶切反應(yīng)體系，成分如表2-6-4-1所示：表2-6.4-1DNA的酶切反應(yīng)體系成分用量DNA0.2–1μg10×酶切緩沖液2.0μL限制性內(nèi)切酶10.4μL限制性內(nèi)切酶20.4μLddH2OTo20μL注：限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，37℃消化2h-4h。若為單酶切檢測則酶量相應(yīng)增加至0.8μL；若雙酶切回收DNA片段時，反應(yīng)總體積達(dá)100μL-200μL，各反應(yīng)組分按比例相應(yīng)增加；多酶消化，若緩沖液相同，可同時加入；若不同，則先做低溫或低鹽buffer的酶切消化，回收DNA片斷后，再做高溫或高鹽buffer的酶切消化。（2）酶切完成后，暫置-20℃保存，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果；（3）配置DNA的體外連接體系，成分如表2.6.4-2所示：表2.6.4-2DNA的體外連接反應(yīng)體系成分用量載體和外源DNA片段XμL連接酶緩沖液2μLT4連接酶0.4μLddH2OTo20μL注：該連接體系中載體和外源DNA片斷的摩爾濃度比約為1：3。（4）將各物質(zhì)按比例加入0.2μL的離心管中，稍離心混勻，置于金屬浴上，16℃連接過夜；（5）將連接體系轉(zhuǎn)化相應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行重組子的篩選。2.6.5質(zhì)粒提取使用試劑盒準(zhǔn)備工作。檢查BufferP1中是否以加入RNaseA。檢查WashSolution中是否已經(jīng)加入無水乙醇。檢查BufferP2和BufferP3是否出現(xiàn)沉淀。取1.5-5mL過夜培養(yǎng)的菌液，8000×g離心2分鐘收集菌體，棄盡培養(yǎng)基。在沉淀中加入250μLBufferP1，徹底懸浮菌體。加入250μLBufferP2，立即溫和顛倒離心管5-10次混勻。室溫靜置2-4分鐘。加入350μLBufferP3，立即溫和顛倒離心管5-10次混勻。12000×g離心5-10分鐘。將上清液移入吸附柱，8000×g離心15秒，倒掉收集管中液體。加入500μLWashSolution，12000×g離心15秒，倒掉收集管中液體。重復(fù)步驟7一次。空吸附柱12000×g離心1分鐘。60℃風(fēng)干3-5分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入40μLElutionBuffer，室溫靜置1分鐘，12000×g離心1分鐘。保存管中溶液。2.6.6T4連接（1）按20μL體系配制DNA的酶切反應(yīng)體系，成分如表2-5-6-1DNA酶切反應(yīng)體系所示：表2-5-6-1DNA酶切反應(yīng)體系成分用量DNA10μL10X酶切緩沖液2μL限制性核酸內(nèi)切酶1KpnI1μL限制性核酸內(nèi)切酶2NdeI1μLddH2O6μL（2）酶切完成后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切結(jié)果，正確后繼續(xù)下列步驟。配制10μLDNA的體外連接體系，成分如下表2.5.6-2DNA的體外連接體系所示:表2.5.6-2DNA體外連接體系成分用量T4連接酶1μL10X

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Buffer1μLDld7μL質(zhì)粒PAcYc-Duet1μL將DNA的體外連接體系加入到酶切反應(yīng)體系，22

℃，連接過夜；將連接體系連接到相應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行從重組子篩選[10]。2.6.7熱激轉(zhuǎn)化（一）感受態(tài)細(xì)胞制備：①向15mL離心管中加入5mLLB液體培養(yǎng)基，并接入Bl21菌種，放至37℃，180rpm搖床中，過夜培養(yǎng)；②轉(zhuǎn)接1-3%的過夜培養(yǎng)物到100mL的新鮮培養(yǎng)基中；③震蕩培養(yǎng)到OD600到0.35-0.40，4℃4000rpm，離心5分鐘，收集菌體；④去上清液，加入0.1倍體積（10mL）預(yù)冷的0.1MMgCl2懸浮，冰浴10分鐘，4℃4000rpm，離心10分鐘；⑤去上清液，加入0.04倍體積（4mL）預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮，冰浴30分鐘，4℃4000rpm，離心10分鐘；⑥取上清液，加入1/25倍體積（2mL）預(yù)冷的0.1M甘油CaCl2懸浮沉淀；⑦以100μL/管分裝至1.5mL離心管，零下70℃保存?zhèn)溆?。（二）將連接物通過熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBl21，具體操作步驟如下：取一管E.coliBl21感受態(tài)細(xì)胞100μL，冰浴5分鐘；將1μL基因轉(zhuǎn)移到感受態(tài)細(xì)胞中（輕柔一兩次），冰浴30分鐘；放至42℃水浴鍋中90秒，使其休克；立即取出放入冰中5分鐘；向管中加入500μLSOC培養(yǎng)基輕柔混勻（用槍頭吸打1-2次）；在37℃，180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)45分鐘；混勻，將轉(zhuǎn)化后的菌液50μL涂布到于含濃度為Cm的LB平板培養(yǎng)基上（無菌操作）；晾干水分后，倒置放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時左右；觀察細(xì)胞生長情況，若滿足要求放至4℃冰箱備用；若不滿足要求，重復(fù)“1”中步驟。2.6.8菌落PCR及菌種保藏菌落PCR：取15-20uLTris-HCl放到編好號的0.5mL的ep管中用滅菌牙簽，或槍頭，沾取少量菌體（多了效果不好）；并將槍頭或牙簽在剛?cè)〕鰜淼腡ris-HCl中涮一下，可以看到溶液略微變渾濁；蓋上管蓋，100℃煮沸5-10min;離心，取1-2uL上清配制PCR反應(yīng)體系。如果菌體較多，則取0.5ul就夠了；設(shè)置PCR儀程序，進(jìn)行反應(yīng)；PCR參數(shù)：95℃預(yù)變5min；→主循環(huán)94℃30s,→54℃30s,→72℃30s,→循環(huán)30次；→終延伸72℃7min；→4℃保存。結(jié)果電泳檢測即可[11]。菌種保藏：菌種短期保藏采用斜面于冰箱4℃保藏，長期保藏是用過夜培養(yǎng)的菌液與40%的滅菌甘油等體積混合，混勻后至于-80℃，可保藏一年以上。若需要保藏時間更長一些的則需要進(jìn)行冷凍干保藏，具體做法如下：將適當(dāng)濃度（一般為10%）的脫脂牛奶1-2mL加入長滿菌苔的固體斜面，充分混勻后，吸取0.5mL加入事先滅菌的凍干管中，用滅菌脫脂棉封口，冷凍干燥，然后抽真空，并同時對管體進(jìn)行加熱熔融，封口。凍干保藏的菌株由于保藏環(huán)境真空度高，濕度小等優(yōu)點，能存貨5-10年[12]。2.6.9基因測序挑取陽性克隆的單菌落，接種于10mL液體LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜；取850μL菌液，混合150μLDMSO，混勻，至于超低溫冰箱保存；分兩部分收集剩余9mL培養(yǎng)液中的菌體，一部分裝入無菌的1.5mL離心管，填寫測序報告單，送樣測序，另一部分抽提質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?.6.10乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線測定乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線測定分別配置濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8g/L的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)濃度；肌酸混合液制備：0.1g肌酸，1g萘酚，4gNaOH，定容至100mL；分別取0.1mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4.5mL肌酸混合液，震蕩混勻；空白對照組：0.1mL蒸餾水+4.5mL肌酸混合液；在30℃水浴鍋中反應(yīng)30min；使用分光光度計測定A522nm值；根據(jù)測定的數(shù)據(jù)制作乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.6.11生長曲線測定使用分光光度法測定菌體的生長濃度，具體操作步驟如下：搖菌：（兩管）向15mL無菌離心管中加入5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基和5μLCm，分別接入基因PAcYc-Duet和基因PAcYc-Dld-Duet，放至37℃，180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，過夜（18h左右）。接種：混勻上述菌液，取1mL混合菌液接入至乳酸培養(yǎng)基（100mL/瓶）中，每100mL培養(yǎng)基加入100μLCm抗性；放至37℃，180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)；每隔2h使用分光光度計測OD600，空白對照組為不接菌的培養(yǎng)基，三個平行組；當(dāng)OD600都達(dá)到0.4后，加入1mMIPTG，每100mL培養(yǎng)基加入100μLIPTG；重復(fù)（4）步驟，直至OD600偏向穩(wěn)定；根以時間為橫坐標(biāo)，OD600平均值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。2.6.12乙偶姻含量測定使用發(fā)酵法測定細(xì)胞產(chǎn)乙偶姻的含量。（PAcYcDuet-AlsS-AlsD-Dld/PAcYc）搖菌：（兩管）向15mL無菌離心管中加入5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基和5μLCm，分別接入基因PAcYc-Duet和基因PAcYcDuet-AlsS-AlsD-Dld，放至37℃，180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，過夜（18h左右）。接種：混勻上述菌液，1%接種至乳酸培養(yǎng)基（50mL/瓶）中，每50mL培養(yǎng)基加入50μLCm抗性，并添加50μL4.5mg/LVB1；培養(yǎng)：放至37℃，200rpm搖床中震蕩培養(yǎng)；從接種種子液開始，每隔6h使用分光光度計法測A600值，并調(diào)pH為7.0；當(dāng)A600都達(dá)到0.8后，加入IPTG；空載體不加，構(gòu)建菌分別加0.05mM、0.1mMIPTG形成比對。（補加：①從接種種子液開始，每隔12小時補加一次乳酸鈉、VB1、IPTG、Cm（按培養(yǎng)基比例補加）；②從加入IPTG開始，每隔12小時補加一次。）測定：每誘導(dǎo)24、48、72小時分別取樣品，檢測乙偶姻含量。取1mL菌液，12000rpm離心2分鐘，取上清液，稀釋10倍；取0.1mL稀釋后的液體加入4.5mL肌酸混合液，30℃水浴鍋中反應(yīng)30min，然后使用分光光度計測定A522nm值，記錄數(shù)據(jù)。計算：根據(jù)2.2.9中所制作的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線測定乙偶姻含量。

3.結(jié)果與分析3.1基因序列分析你好[13]3.2質(zhì)粒載體構(gòu)建3.2.1質(zhì)粒載體構(gòu)建本實驗中主要用到Duet-up2、Duet-down1、T7-term、pACYCDuet-up1四種克隆和表達(dá)用質(zhì)粒載體。首先PCR擴(kuò)增基因并將目的基因克隆到Duet-up2載體上，然后通過DNA限制性內(nèi)切酶消化和DNA連接酶連接，將目的基因轉(zhuǎn)移到所需要的表達(dá)載體上，從而構(gòu)建其他三個系列的質(zhì)粒，如圖3-2-1所示。3.2.2構(gòu)建載體質(zhì)粒以貝萊斯枯草芽孢桿菌的總DNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增Dld基因，基因上下游分別引入NdeI（BamHI）和KpnI酶切位點，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T4克隆，分別連接到PAcYcDuet-1載體上，得到PAcYcDuet-AlsS-AlsD-Dld質(zhì)粒（圖3-2-2），酶切分析及測序表明所克隆的基因正確。3.3乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)濃度取不同標(biāo)準(zhǔn)濃度0.1mL的乙偶姻溶液，與4.5mL肌酸混合液震蕩混勻，在30℃水浴鍋中反應(yīng)30min；空白對照組為0.1mL蒸餾水+4.5mL肌酸混合液；測定OD522nm值時稀釋4倍。結(jié)果見表3-5，圖3-5。表3-5標(biāo)準(zhǔn)乙偶姻濃度的A522（稀釋4倍）乙偶姻濃度mg/L0.00.8A5220.2050.4410.9962.1723.134圖3-5根據(jù)圖3-5所示，標(biāo)準(zhǔn)乙偶姻濃度與其A522值的線性方程最終計算出為：y=15.867X+0.6395。3.4生長速率測定3.4.1空載體與PAcYc-Dld-Duet重組菌的生長曲線將培養(yǎng)24h后的空載體菌（PAcYc-Duet）、與PAcYc-Dld-Duet重組菌懸液，分別以1%的量接種于pH7.0的以乳酸為碳源的液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃，180r/min培養(yǎng)，每隔2h取一次樣，每次測3組平行樣，取平均值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600的值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。結(jié)果見表3-6-1-1、3-6-1-2和圖3-6-1-1、3-6-1-2。表3-6-1-1基因PAcYc-Dld-Duet重組菌OD600值時間/h024689.510.5111.512.5加IPTG00.0230.1310.4030.6570.80200.9300.99101.078未加00.0210.1290.3640.5730.6640.7300.7730.868時間/h14.516.518.520.522.524.525.527.530加IPTG1.2941.3051.3921.5311.6291.6041.7061.6991.727未加1.0951.1711.3621.4441.5351.6481.6241.7071.840時間/h3234363840加IPTG1.7311.8252.0302.06672.090未加1.8071.9492.0202.0372.053表3-6-1-2空載體菌OD600值時間/h0244.2