Western blot資料課件完整版

印跡技術(shù)（blotting）印跡（blotting）是指將凝膠中的待測(cè)核酸等樣品用類似于吸墨跡的方法轉(zhuǎn)移到固相膜上，轉(zhuǎn)移之后待測(cè)樣品在固相膜上的相對(duì)位置保持不變。探針（probe)：廣義上講，探針是指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測(cè)的分子。如：抗原－抗體，生物素－親合素，受體－配體等。印跡技術(shù)分類DNAblotting：SouthernblottingRNAblotting：NorthernblottingWesternblotting：immunoblotting一、定義Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法。二、原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。WesternBlot基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測(cè)。WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色三、過程1、提取蛋白質(zhì)RIPA裂解液Tris.cl(pH7.5)50mMNacl150mMNP-401%脫氧膽酸鈉0.5%SDS0.1%EDTA1mMPMSF1mMNa3VO41mM現(xiàn)用現(xiàn)加（提取總蛋白，主要是胞漿蛋白的裂解液）

其中的NaCl和Trisbase是構(gòu)成提取液的主要成分，起到緩沖液的作用，緩沖液可以對(duì)抗蛋白質(zhì)溶液PH值的改變，因此對(duì)于保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定以及保證實(shí)驗(yàn)重復(fù)性十分重要。

EDTA為金屬離子鰲合劑，由于細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性需要金屬離子的存在，因此加入鰲合劑后可以抑制蛋白酶的活性，也就可以防止蛋白被分解。

而脫氧膽酸鈉和SDS都是屬于陰離子型去垢劑。使用這些去垢劑的作用是可以將蛋白質(zhì)以單體的形式分離。

NP-40屬于非離子型去垢劑，與離子型去垢劑相比，其對(duì)蛋白之間的相互作用干擾較弱，但是對(duì)于分離功能性的蛋白復(fù)合物較為適用。

PMSF：苯甲基磺酰氟，Na3VO4是Na-K+ATP酶的抑制劑

兩者都是蛋白酶抑制劑。2、蛋白定量：測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)濃度。（1）凱氏定氮（2）測(cè)定OD280：可測(cè)定芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）的含量，但易受組成和雜質(zhì)的影響。（3）考馬斯亮藍(lán)G250染色：側(cè)鏈集團(tuán)與G250顯色，

根據(jù)深淺測(cè)定蛋白質(zhì)含量。（4）福林－酚試劑法（Lowry)蛋白質(zhì)的酪氨酸、色氨酸半胱氨酸的殘基＋Cu2+OH－紫色化合物紫色化合物還原磷鉬酸、磷鎢酸藍(lán)色化合物比色測(cè)定分光光度計(jì)原理：在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物。（雙縮脲反應(yīng)BiuretReaction）蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物使酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸還原，生成鉬藍(lán)-鎢藍(lán)藍(lán)色化合物，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比的關(guān)系可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。（還原反應(yīng)）常用改良的Lowry法：123456sample1sample2sample312481632101010(μl)BSA(1mg/ml)999998996992984968990990990(μl)NS濃度（μg/μl)12481632+A液0.9ml50℃，10min+B液0.1ml室溫，10min+C液3ml50℃，10min平衡到室溫，650nm測(cè)吸光度值（2g酒石酸鉀鈉＋100gNacl溶于500ml1MNaOH中，再定容至1000ml）（2g酒石酸鉀鈉＋1g5H2O.CuSO4，先溶于少量水中，再定容至90ml，再加入10ml1MNaOH）（市售的酚試劑，1:15稀釋）改良的Lowry法：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線51015202530濃度（ug/ul)A6500.250.501.000.73樣品濃度3、SDS－PAGE不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS（與蛋白結(jié)合，使蛋白變性，亞基分開，并使蛋白質(zhì)帶上相同的電荷，這樣蛋白在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度只與其單個(gè)亞基的分子大小有關(guān)，與其空間構(gòu)象和本身帶電多少無關(guān)）濃縮膠分離膠5％，pH＝6.88％，pH＝8.8SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素。濃縮原理：濃縮膠中Arc的濃度是5％，形成的孔徑大，蛋白泳動(dòng)快分離膠中Arc的濃度是8％，形成的孔徑小，蛋白泳動(dòng)慢蛋白質(zhì)擁擠在交界面處Tris－甘氨酸系統(tǒng)濃縮膠pH=6.8，泳動(dòng)速度為Cl>蛋白質(zhì)>甘氨酸分離膠pH=8.8，甘氨酸不再影響蛋白泳動(dòng)—＋Cl－

Cl－

Cl－

Cl－Gly-Gly-Gly-Gly-樣品進(jìn)入分離膠前，先經(jīng)過大孔徑濃縮膠的遷移作用而被濃縮至一極窄的區(qū)帶。其作用原理是在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH值時(shí)，任何時(shí)候都只有一部分分子帶負(fù)電。如樣品和濃縮膠均用pH6.7的Tris－HCI緩沖液，電極液用Tris一甘氨酸緩沖液。此時(shí)，甘氨酸很少解離，其有效泳動(dòng)率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)率，蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)率介于氯離子和甘氨酸之間。一旦加上電壓，作為先導(dǎo)離子的氯離子和作為尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，并加速甘氨酸的泳動(dòng)，使其趕上氯離子,建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)率乘積的相等的穩(wěn)定態(tài)，使這些帶電顆粒以相同速度泳動(dòng)，兩種離子之間具有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，在界面后有一高電壓梯度。由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速度比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃縮作用僅取決于樣品和濃縮膠中的Tris－HCI的濃度，而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對(duì)樣品沒有分子篩作用。當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH值明顯增加，并導(dǎo)致甘氨酸的大量解離。此時(shí)甘氨酸的有效泳動(dòng)率增加，使它越過蛋白質(zhì)并直接在氯離子后移動(dòng)。同時(shí)由于凝膠孔徑變小，使蛋白質(zhì)分子的遷移率減小。于是蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。+5×電泳緩沖液Gly23.5gTris3.375g250mlH2O使用時(shí)：76ml5×bf+4ml10%SDS400ml5×loadingbf0.5MTris.clpH6.85mlSDS1gβ-巰基乙醇0.6ml50%甘油8ml0.25%溴酚藍(lán)1mlH2O44ml使用時(shí)與蛋白樣品混合，稀釋成1×，100℃煮沸5min聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（單丙）和甲叉雙丙烯酰胺（雙丙）聚合而成聚合過程需要催化劑。分離膠8％30％Arc2.16ml0.67ml

(29g單丙＋1g雙丙100ml)1MTris.clpH=8.83ml0.5ml(pH6.8)10%SDS80ul40ul10%AP80ul40ulTEMED5ul4ulH2O2.67ml2.7ml8ml4ml濃縮膠5％催化劑120v1-2h聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidgelelectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酸胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（Acrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N，Nˊ_甲叉雙丙烯酰胺N，Nˊ一Methylenebisacrylamide，Bis)，在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合而成的?；瘜W(xué)聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨（Ap）在形成中提供自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)。催化劑是四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine,TEMED）則可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度，具體反應(yīng)是過硫酸銨在水溶液中形成一個(gè)過硫酸自由基，此自由基可以激活TEMED，TEMED作為一個(gè)電子載體提供一個(gè)未配對(duì)電子將丙烯酰胺單體轉(zhuǎn)換化成丙烯酰胺自由基經(jīng)反應(yīng)多聚物聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠狀，其網(wǎng)狀孔徑大小由聚合條件及單體濃度決定。S2O82-2SO4-丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時(shí)間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時(shí)凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機(jī)械強(qiáng)度而又不影響凝膠孔徑大小。凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。8.38.38.96.7凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-2124、轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)移，PVDF膜10Ⅹ轉(zhuǎn)膜緩沖液Gly14.5gTris29gSDS1.85g500ml使用時(shí)：100ml10Ⅹ轉(zhuǎn)膜bf用水稀釋成800ml，再加200ml甲醇（濃度為20％，起固定蛋白的作用，邊轉(zhuǎn)膜邊固定）90V，2－3h（90kDa)，根據(jù)所測(cè)蛋白的分子量決定。膜的選擇：NC：蛋白結(jié)合量80~100μg/cm2，機(jī)械強(qiáng)度小，脆性大尼龍：蛋白結(jié)合量200μg/cm2，機(jī)械強(qiáng)度高，單易被染料染色。PVDF（聚乙烯二氟）：綜合以上優(yōu)點(diǎn)，但需要激活預(yù)處理。轉(zhuǎn)膜方法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。

Western裝置蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)DaDaltonSDSPAGE轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色直接染色電泳結(jié)果5、封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）封閉液5％脫脂奶粉1％BSA方法室溫振蕩4－5h37℃2h4℃過夜6、一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時(shí)，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，37℃一小時(shí)，4℃過夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min?？捎梅忾]液或TTBS稀釋一抗到合適的濃度例如：檢測(cè)大鼠actin蛋白，使用兔抗大鼠的actin抗體（1：1000）

TTBS5ml+5ul抗體室溫振蕩4－5h37℃2h4℃過夜方法沒有注明可以用來做westernblot的一抗，可以用來做westernblot嗎？

不一定,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于westernblotting，因?yàn)樵趙esternblotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。7、顯色4－氯－1－萘酚顯色TBS8ml4－氯－1－萘酚1.6ml(甲醇配制的3mg/ml溶液）30%H2O24ul避光顯色5－10min發(fā)光顯影發(fā)光試劑A和B，等體積混合后，可與辣根過氧化物酶反應(yīng)，發(fā)出綠色熒光，使X光片顯影。DAB顯色二氨基聯(lián)苯胺與辣根過氧化物酶反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO