酶工程第一章緒論課件

酶工程EnzymeEngineering

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主要參考書

?郭勇主編，酶工程。北京：中國輕工業(yè)出版社，2002?羅貴民主編，酶工程。北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002?陳石根，周潤琦編著，酶學(xué)。上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001?郭勇，鄭穗平編著，酶學(xué)。廣州：華南理工大學(xué)出版社，20002現(xiàn)代生物工程：1.基因工程（geneengineering）2.細(xì)胞工程（cellengineering）3.酶工程（enzymeengineering）4.發(fā)酵工程（fermentationengineering）5.蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）3第一章緒論

(ENZYMEENGINEERING)

酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。其特點(diǎn)是利用酶、含酶細(xì)胞器或細(xì)胞(微生物、植物、動(dòng)物)作為生物催化劑來完成某些重要的化學(xué)反應(yīng)。

15第一節(jié)酶工程概述第二節(jié)酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制第三節(jié)酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)第四節(jié)影響酶活力的因素第五節(jié)酶動(dòng)力學(xué)和抑制作用6生物技術(shù)的四大支柱7

第一節(jié)酶工程概述

一、酶與酶工程發(fā)展簡史（一）酶學(xué)研究簡史1.不自覺的應(yīng)用：釀酒、造醬、制飴糖、治病2.酶學(xué)的產(chǎn)生:消化與發(fā)酵現(xiàn)象9（1）消化法國著名科學(xué)家雷默（1683-1757）認(rèn)為消化是一個(gè)在胃液作用的化學(xué)過程而不僅僅是一個(gè)物理過程。1777年，意大利物理學(xué)家Spallanzani(斯帕蘭扎尼)

的山鷹實(shí)驗(yàn)。證明在胃液中存在一些特殊的活性成分1822年，美國外科醫(yī)生Beaumont研究食物在胃里的消化。19世紀(jì)30年代，德國科學(xué)家施旺獲得胃蛋白酶。10（2）發(fā)酵1684年，比利時(shí)醫(yī)生Helment提出

ferment—引起釀酒過程中物質(zhì)變化的因素（酵素）。1833年，法國化學(xué)家Payen

(佩恩)和Person(帕索茲)

用酒精處理麥芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。1878年，德國科學(xué)家K?hne(庫尼)提出

enzyme—從活生物體中分離得到的酶，意思是“在酵母中”（希臘文）。11Buchner兄弟的試驗(yàn)：用細(xì)砂研磨酵母細(xì)胞，壓取汁液，汁液不含活細(xì)胞，但仍能使糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳。證明：發(fā)酵與細(xì)胞的活動(dòng)無關(guān)。1314

酶——活細(xì)胞產(chǎn)生的，能在細(xì)胞內(nèi)外起作用的（催化）生理活性物質(zhì)。enzyme—organicchemicalsubstance(acatalyst)formedinlivingcells,abletocausechangesinothersubstancewithoutbeingchangeditself.

酶的化學(xué)本質(zhì)？1517181921（2）酶學(xué)理論研究1890年，F(xiàn)isher——鎖鑰學(xué)說。1902年，Henri——中間產(chǎn)物學(xué)說。1913年，Michaelis和Menten——米氏學(xué)說。1958年，Koshland——誘導(dǎo)契合學(xué)說。1960年，Jacob和Monod——操縱子學(xué)說。22CharacteristicsofenzymeactivesitesLockandkeymodel(鎖鑰)1890picturebyEmilfisher.Thismodelassumedthatonlyasubstrateofthepropershapecouldfitwiththeenzyme.Induced–fitmodel(誘導(dǎo)契合)proposedbyDanielKoshlandin1958.Thismodelassumescontinuouschangesinactivesitestructureasasubstratebinds.23中間產(chǎn)物學(xué)說ESPSE25StepsinanenzymaticreactionEnzymeandsubstratecombinetoformaComplex.Complexgoesthroughatransitionstate---notquitesubstrateorproductAcomplexoftheenzymeandtheproductisproducedFinallytheenzymeandproductseparateAllofthesestepsareequilibria.Letsrevieweachstep.

262930Michaelis-Mentenequation31酶——是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)。

是否所有的酶都是蛋白質(zhì)？32（3）核酶的發(fā)現(xiàn)

1982年，ThomasR.Cech(切克)等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞的26SrRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然RNA稱為核酶—Ribozyme。1983年，Altman(阿爾特曼)等人發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶P的RNA組分具有加工tRNA前體的催化功能。而RNaseP中的蛋白組分沒有催化功能，只是起穩(wěn)定構(gòu)象的作用。

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核酶的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶的概念，即“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)或RNA）。酶分兩大類：主要由蛋白質(zhì)組成——蛋白類酶（P酶）主要由核糖核酸組成——核酸類酶（R酶）

34（二)酶工程研究簡史（應(yīng)用研究）1894年，日本的高峰讓吉用米曲霉制備得到淀粉酶，開創(chuàng)了酶技術(shù)走向商業(yè)化的先例。1908年，德國的Rohm用動(dòng)物胰臟制得胰蛋白酶，用于皮革的軟化及洗滌。1908年，法國的Boidin制備得到細(xì)菌淀粉酶，用于紡織品的褪漿。1911年，Wallerstein從木瓜中獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。35

1949年，用微生物液體深層培養(yǎng)法進(jìn)行－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了近代酶工業(yè)的序幕。1960年，法國科學(xué)家Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過酶的誘導(dǎo)和解除阻遏，可顯著提高酶的產(chǎn)量。

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在酶的應(yīng)用過程中，人們注意到酶的一些不足之處，如：穩(wěn)定性差，對強(qiáng)酸堿敏感，只能使用一次，分離純化困難等。解決的方法之一是固定化。37固定化技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。

1969年，日本千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產(chǎn)L－氨基酸。1971年，第一屆國際酶工程會(huì)議在美國召開，會(huì)議的主題是固定化酶。38

二.酶工程簡介

由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新的技術(shù)科學(xué)。它從應(yīng)用目的出發(fā)，研究酶的產(chǎn)生、酶的制備與改造、酶反應(yīng)器以及酶的各方面應(yīng)用。分為：化學(xué)酶工程與生物酶工程。39化學(xué)酶工程（初級酶工程）酶化學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。主要研究內(nèi)容：酶的制備、酶的分離純化、酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶分子修飾、酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用。2.生物酶工程（高級酶工程）在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、酶學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。

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生物酶工程主要研究內(nèi)容（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治療血栓病的有效藥物。用DNA重組技術(shù)將人尿激酶原的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，可使大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)人尿激酶原，從而取代從大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白質(zhì)工程技術(shù)定點(diǎn)改變酶結(jié)構(gòu)基因（突變酶）如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的絲氨酸），使該酶對底物ATP的親和力提高了100倍。（3）設(shè)計(jì)新的酶結(jié)構(gòu)基因，生產(chǎn)自然界從未有過的性能穩(wěn)定、活性更高的新酶。41生物酶工程示意圖42酶工程原理和基本過程菌種→擴(kuò)大培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵酶液→酶的提取→酶成品

原料→前處理→殺菌→酶反應(yīng)器←↓

反應(yīng)液→產(chǎn)品提取→產(chǎn)品酶的固定化43思考題：酶工程的概念、分類及其研究內(nèi)容。Payen和Person、Buchner兄弟、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam及千佃一郎對酶學(xué)的主要貢獻(xiàn)是什么？44應(yīng)用范圍包括:醫(yī)藥、食品、化學(xué)工業(yè)，診斷分析和生物傳感器等。諸如糖化酶、淀粉酶、洗滌用酶以及與β-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)有關(guān)的青霉素?；?、7-ACA酰化酶等，其市場需求、生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)值均很可觀，并已產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著酶的大量應(yīng)用，各種酶反應(yīng)器和固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，更進(jìn)一步地推動(dòng)了酶工程的發(fā)展。45當(dāng)代酶工程發(fā)展的趨勢之一是尋找耐極端條件的酶，如耐高溫、耐酸堿、耐鹽等。這些酶存在于嗜高溫、嗜酸堿、嗜高鹽的細(xì)菌中。近年來對這些細(xì)菌的研究進(jìn)展迅速，這將為酶工業(yè)提供源源不斷的新型酶類。46酶有多少種?現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在的酶有近8000種，而且每年都有新酶發(fā)現(xiàn)。迄今，數(shù)百種酶已純化達(dá)到了均一純度，大約有200多種酶得到了結(jié)晶。由于蛋白質(zhì)分析分離技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是在運(yùn)用x射線衍射分析等方法后，人們相繼弄清了溶菌酶(129個(gè)氨基酸殘基)、胰凝乳蛋白酶(245個(gè)氨基酸殘基)、羧肽酶(307個(gè)氨基酸殘基)、多元淀粉酶A(460個(gè)氨基酸殘基)等的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理。現(xiàn)在對于細(xì)胞基本代謝過程中的各種酶，很多已有比較清楚的認(rèn)識，但有關(guān)遺傳過程中的酶還有待深入研究。47酶是生物體內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制、新陳代謝所不可缺少的生物催化劑。由于酶能在常溫、常壓、中性pH等溫和條件下高度專一有效地催化底物發(fā)生反應(yīng)，所以酶的開發(fā)和利用是當(dāng)代新技術(shù)革命中的一個(gè)重要課題。酶工程主要指自然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，

由4個(gè)部分組成：①酶的產(chǎn)生；②酶的分離純化；③酶的固定化；④生物反應(yīng)器。48酶工程的發(fā)展歷史:一般認(rèn)為，酶工程的發(fā)展歷史應(yīng)從第二次世界大戰(zhàn)后算起。從20世紀(jì)50年代開始，由微生物發(fā)酵液中分離出一些酶，制成酶制劑。60年代后，由于固定化酶、固定化細(xì)胞崛起，使酶制劑的應(yīng)用技術(shù)面貌一新。70年代后期以來，由于微生物學(xué)、遺傳工程及細(xì)胞工程的發(fā)展為酶工程進(jìn)一步向縱深發(fā)展帶來勃勃生機(jī)，從酶的制備方法、酶的應(yīng)用范圍到后處理工藝都受到巨大沖擊。盡管目前業(yè)已發(fā)現(xiàn)和鑒定的酶約有8000多種，但大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的商品酶只有數(shù)十種。。

849自然酶在工業(yè)應(yīng)用上受到限制的原因主要有：

①大多數(shù)酶脫離其生理環(huán)境后極不穩(wěn)定，而酶在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中的條件往往與其生理環(huán)境相去甚遠(yuǎn)；②酶的分離純化工藝復(fù)雜；③酶制劑成本較高50固定化酶較自由酶具有很多優(yōu)點(diǎn)：①穩(wěn)定性高；②酶可反復(fù)使用；③產(chǎn)物純度高，副產(chǎn)物少，從而有利提純；④生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化；⑤設(shè)備小型化，節(jié)約能源等。因此固定化酶研究仍是酶工程研究的中心，其應(yīng)用范圍越來越廣。除應(yīng)用于傳統(tǒng)的食品工業(yè)(乳糖的分解、乳酪制造、牛奶消毒、酒精生產(chǎn)等)外，在其他領(lǐng)域如有機(jī)合成反應(yīng)、分析化學(xué)、醫(yī)療、廢液處理、親和層析等也獲得廣泛應(yīng)用。51在固定化酶的基礎(chǔ)上又逐漸發(fā)展固定化細(xì)胞的技術(shù)近年來，后來居上的固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)展更為迅速，在實(shí)際應(yīng)用方面已大大超過固定化酶。在工業(yè)應(yīng)用方面，利用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精、啤酒的研究較引入注目。日本ToshioOnaka等用海藻酸鈣凝膠包埋酵母細(xì)胞，可在一天內(nèi)獲得質(zhì)量優(yōu)良的啤酒。法國Corriell等將酵母細(xì)胞固定在聚氯乙烯碎片和多孔磚等載體上進(jìn)行啤酒發(fā)酵中型試驗(yàn)，可連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)8個(gè)月。中國上海工業(yè)微生物研究所等單位也從20世紀(jì)70年代后期進(jìn)行過類似的研究工作，用固定化酵母發(fā)酵啤酒的規(guī)模不斷擴(kuò)大，已正式投入大規(guī)模生產(chǎn)。

1052基因工程與酶工程相結(jié)合1980年，Wagner等人報(bào)道，將大腸桿菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到質(zhì)粒上，獲得產(chǎn)酶活力更高的大腸桿菌5K(PHMl2)雜交株，并將此大腸桿菌雜交株固定，用于生產(chǎn)青霉素?；?。這是基因工程與酶工程相結(jié)合的第一例。近年來，有關(guān)藻類等各種植物細(xì)胞、原生動(dòng)物等各種動(dòng)物細(xì)胞固定化研究十分活躍。1980年，Lim和Sun報(bào)道，用海藻酸鈣包埋胰島細(xì)胞可用于大白鼠糖尿病的治療研究。53酶分子的改造和修飾酶制劑的應(yīng)用并不一定都需要固定化，而且需要固定化的天然酶也仍有必要提高其活力，改善其某些性質(zhì)，以便更好地發(fā)揮酶的催化功能。由此而提出了酶分子的改造和修飾。在第七屆國際酶工程會(huì)議上，以酶分子改造和修飾為主要內(nèi)容的提高酶穩(wěn)定性的研究占較大比例，它與基因工程的應(yīng)用、活細(xì)胞的固定化一起，成為1983年國際酶工程會(huì)議最為活躍的三大領(lǐng)域。544

通常將改變酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的過程稱為改造，而將酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的共價(jià)變化稱為修飾。酶分子經(jīng)加工改造后，可導(dǎo)致有利于應(yīng)用的許多重要性質(zhì)與功能的變化。如德重等利用蛋白水解酶的有限水解作用，已將L-天冬氨酸酶的活力提高3～6倍。美國Davis等人還利用蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾作用，研究降低或解除異體蛋白的抗原性及免疫原性。以聚乙二醇修飾治療白血病的特效藥L-天冬酰胺酶，使其抗原性完全解除。1155在酶工程研究中，與酶分子本身不直接有關(guān)的有兩項(xiàng)重要內(nèi)容：酶生物反應(yīng)器的研究和酶抑制劑的研究。

酶生物反應(yīng)器往往可以提高催化效率、簡化工藝，從而增加經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)合固定化技術(shù)，業(yè)已發(fā)展成酶電極、酶膜反應(yīng)器、免疫傳感器及多酶反應(yīng)器等新技術(shù)。這在化學(xué)分析、臨床診斷與工業(yè)生產(chǎn)過程的監(jiān)測方面成為很有價(jià)值的應(yīng)用技術(shù)。

酶抑制劑，尤其是微生物來源的菌抑制劑多是重要抗生素。酶抑制劑還可在代謝控制、生物農(nóng)藥、生物除草劑等方面發(fā)揮特殊作用，其低毒性備受人們歡迎。酶抑制劑的開發(fā)業(yè)已受到國際產(chǎn)業(yè)部門的重視。1256從酶工程的進(jìn)展和動(dòng)態(tài)中可以預(yù)料，今后將會(huì)出現(xiàn)一批基因工程表達(dá)的酶制劑，親和層析技術(shù)仍將得到廣泛應(yīng)用，并會(huì)出現(xiàn)一個(gè)應(yīng)用經(jīng)分子改造與修飾的酶制劑的熱潮。異體酶的抗原性將得到解決。在酶活性的控制方面將會(huì)有較大突破，其中酶抑制劑與激活劑仍將受到極大重視，并在臨床及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。在化學(xué)合成工業(yè)中，酶法生產(chǎn)將有重大貢獻(xiàn)，模擬酶、酶的人工設(shè)計(jì)合成、抗體酶、雜交酶將成為活躍的研究領(lǐng)域。非水系統(tǒng)酶反應(yīng)技術(shù)(反向膠束中的酶促反應(yīng)、有機(jī)溶劑中的酶反應(yīng))也仍將是研究熱點(diǎn)之一。1357第二節(jié)酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制

1458一、酶的分類2-根據(jù)酶所催化的反應(yīng)性質(zhì)酶學(xué)研究早期，無系統(tǒng)的命名法則1-根據(jù)酶的作用底物命名淀粉酶蛋白酶脂肪酶氧化酶還原酶轉(zhuǎn)氨酶59缺點(diǎn)缺乏系統(tǒng)性，常常會(huì)不可避免地出現(xiàn)一酶數(shù)名或一名數(shù)酶的混亂情況60國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)InternationalUnionofBiochemistry簡稱IUB1961年提出1965、1972、1978、1984修改、補(bǔ)充系統(tǒng)命名法國際分類法61

1961年國際生化聯(lián)合會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出將酶分成6類。許多酶是由它們底物名稱加上后綴“-ase”命名。因此脲酶(urease)是催化尿素(urea)水解的酶。果糖-1，6-二磷酸酶(fluctose-l，6-diphosphatase)是水解果糖-l，6-二磷酸的酶。然而，有些酶(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的命名并末表示它的底物名稱。有些酶有多種不同的名稱。為了使酶的名稱合理，國際上已公認(rèn)一種酶的命名(enzymenomenclature)系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)將所有的酶根據(jù)其反應(yīng)催化的類型安置到6種主要類型的某一種中(表1-1)。62

63酶1-氧化還原酶類2-轉(zhuǎn)移酶類3-水解酶類6-合成酶類5-異構(gòu)酶類4-裂解酶類1國際系統(tǒng)分類法64EC命名法ECx.y.z.nEC為酶學(xué)委員會(huì)EnzymeCommission亞亞類下的具體的個(gè)別酶的順序號各亞類下的亞亞類酶所屬大類1~6大類下的亞類x,y,z編號中的前三個(gè)數(shù)字表明了該酶的特性如反應(yīng)物的種類、反應(yīng)的性質(zhì)65此外每種酶各有一個(gè)獨(dú)自的4個(gè)數(shù)字的分類編號，例如胰蛋白酶有一由國際生化聯(lián)合會(huì)團(tuán)委員會(huì)公布的酶分類(用EC標(biāo)示)編號為3、4、2l、4，這里第一個(gè)數(shù)字“3”表示它是水解酶；第二個(gè)數(shù)字“4”表示它是蛋白酶水解肽鍵；第三個(gè)數(shù)字“21”表示它是絲氨酸蛋白酶，在活性部位上有一至關(guān)重要的絲氨酸殘基；第四個(gè)數(shù)字“4”表示它是這一類型中被指認(rèn)的第四個(gè)酶。作為對照，胰凝乳蛋白酶的EC編號為3、4、2l、l，彈性蛋白酶編號為3、4、21、36。66值得注意的是來自不同物種或同一物種的不同組織或不同細(xì)胞器的同一種酶，雖然他們催化同一個(gè)生化反應(yīng)，但它們本身的一級結(jié)構(gòu)可能并不相同，命名也有所區(qū)別CuZn-SODMn-SODFe-SODCuZn-SOD牛細(xì)胞CuZn-SOD豬細(xì)胞CuZn-SODSOD討論一個(gè)酶時(shí)，需要說明來源和名稱6715(1)氧化還原酶在體內(nèi)參與產(chǎn)能、解毒和某些生理活性物質(zhì)的合成。重要的有各種脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、氧合酶、細(xì)胞色素氧化酶等。(2)轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)將某基團(tuán)從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一化合物，參與核酸、蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝和合成。重要的有一碳基轉(zhuǎn)移酶、酮醛基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、糖苷基轉(zhuǎn)移酶、含氮基轉(zhuǎn)移酶、磷酸基轉(zhuǎn)移酶、含硫基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶等(3)水解酶在體內(nèi)外起降解作用，也是人類應(yīng)用最廣的酶類。重要的有各種脂肪酶、糖苷酶、肽酶等。水解酶一般不需輔酶。68(4)裂合酶這類酶可脫去底物上某一基團(tuán)而留下雙鍵，或可相反地在雙鍵處加入某一基團(tuán)。它們分別催化C—C、C—O、C—N、C—S、C—X(F，C1，Br，I)和P-O鍵。16(6)連接酶(合成酶)這類酶關(guān)系很多生命物質(zhì)的合成，其特點(diǎn)是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作為結(jié)合能源，有的還需金屬離子輔助因子。分別形成C—O鍵(與蛋白質(zhì)合成有關(guān))、C—S鍵(與脂肪酸合成有關(guān))、C—C鍵和磷酸酯鍵。(5)異構(gòu)酶此類酶為生物代謝需要而對某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋差向異構(gòu)、順反異構(gòu)、醛酮異構(gòu)、分子內(nèi)轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)裂解等。69二、酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)70酶的結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)71酶的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)示意圖72酶的空間結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)酶的空間結(jié)構(gòu)73酶的一級結(jié)構(gòu)酶分子中氨基酸的排列順序。酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)酶的一級結(jié)構(gòu)74酶的二級結(jié)構(gòu)多肽鏈主鏈原子的局部空間排列酶的二級結(jié)構(gòu)沒有考慮到它的側(cè)鏈的構(gòu)象或與其它部分的相互關(guān)系螺旋結(jié)構(gòu)β-折疊75酶蛋白的-螺旋結(jié)構(gòu)76酶蛋白的折疊結(jié)構(gòu)77由-螺旋、折疊和隨機(jī)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的溶菌酶的空間結(jié)構(gòu)78酶的三級結(jié)構(gòu)指單一的多肽鏈或共價(jià)連接的多肽鏈中，所有原子在空間上的排列酶的三級結(jié)構(gòu)在二極結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，肽鏈通過進(jìn)一步轉(zhuǎn)曲折疊而成79酶的四級結(jié)構(gòu)各亞基在寡聚酶中的空間排布及其相互作用不考慮亞基的內(nèi)部幾何形狀酶的四級結(jié)構(gòu)80酶的四級結(jié)構(gòu)81二、酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)，因而酶必然有四級空間結(jié)構(gòu)形式，其中：一級結(jié)構(gòu)是指具有一定氨基酸順序的多肽鏈的共價(jià)骨架，二級結(jié)構(gòu)為在一級結(jié)構(gòu)中相近的氨基酸殘基間由氫鍵的相互作用而形成的帶有螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲等細(xì)微結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)系在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行分子盤曲的形成包括主側(cè)鏈的專一性三維排列，四級結(jié)構(gòu)是指低聚蛋白中各折疊多肽鏈在空間的專一性三維排列。具有低聚蛋白結(jié)構(gòu)的酶(寡聚酶)必須具有正確的四級結(jié)構(gòu)才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被廣泛折疊、結(jié)構(gòu)緊密的多肽鏈，其氨基酸親水基團(tuán)在外表，而疏水基團(tuán)向內(nèi)。1782單體酶酶的存在類別寡聚酶多酶融合體多酶復(fù)合體83單體酶一條肽鏈組成單體酶分子量通常在35kDa以下不含四級結(jié)構(gòu)單體酶的種類很少，一般多是催化水解反應(yīng)的酶，絕大多數(shù)單體酶只表現(xiàn)一種酶活性84寡聚酶兩個(gè)或兩個(gè)以上亞基組成寡聚酶分子量一般高于30kDa含四級結(jié)構(gòu)相當(dāng)數(shù)量的寡聚酶是調(diào)節(jié)酶，其活性可受各種形式的靈活調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)控制代謝過程中起著非常重要的作用構(gòu)成寡聚酶的亞基可以是相同的，也可以是不同的，亞基與亞基之間一般是以非共價(jià)鍵、對稱的形式排列85寡聚酶86多酶復(fù)合體兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶多酶復(fù)合體靠共價(jià)鍵連接一個(gè)酶催化一個(gè)反應(yīng)，所有反應(yīng)依次連接，構(gòu)成一個(gè)代謝途徑或代謝途徑的一部分，由于這一連串反應(yīng)是在一高度有序的多酶復(fù)合體內(nèi)完成，反應(yīng)效率非常高87多酶復(fù)合體酶2酶3酶1酶4酶6酶588一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，這些酶可以是單體酶，也可以是寡聚酶或是更復(fù)雜的多酶復(fù)合體多酶融合體89酶蛋白有3種組成形式①單體酶，僅有一個(gè)活性部位的多肽鏈構(gòu)成的酶，分子質(zhì)量為13～35ku(1u=1Dalton)。為數(shù)不多，且都是水解酶；②寡聚酶，由若干相同或不同亞基結(jié)合而組成的酶，亞基一般無活性，必須相互結(jié)合才有活性，分子質(zhì)量為35ku以上到致百萬單位；③多酶復(fù)合體，指多種酶進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)的體系。前一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物為后一反應(yīng)的底物。僅有少部分酶是由單一蛋白部分所組成，即酶蛋白本身無活性，需要在輔因子存在下才有活性。輔因子可以是無機(jī)離子，也可以是有機(jī)化合物，它們都屬于小分子化合物。有的酶僅需其中一種，有的酶則二者都需要。約有25％的酶含有緊密結(jié)合的金屬離子或在催化過程中需要金屬離子，包括鐵、銅、鋅、鎂、鈣、鉀、鈉等，它們在維持酶的活性和完成酶的催化過程中起作用。

1890酶的組成一.酶的化學(xué)組成1.單成分酶（單純蛋白質(zhì)/簡單蛋白質(zhì)）2.雙成分酶（結(jié)合蛋白質(zhì)）(1)蛋白質(zhì)部分（酶蛋白）

穩(wěn)定輔因子(2)非蛋白質(zhì)部分（輔因子）

起催化作用

小分子有機(jī)化合物金屬離子

全酶=酶蛋白+輔因子9119有機(jī)輔因子可依其與酶蛋白結(jié)合的程度分為輔酶和輔基。前者為松散結(jié)合；后者為緊密結(jié)合，但有時(shí)把它們統(tǒng)稱為輔酶。大多數(shù)輔酶為核苷酸和維生素或它們的衍生物(表l-2)。它經(jīng)常是生物體食物的必需成分，因此當(dāng)供應(yīng)不足時(shí)，即引起缺乏性疾病。上述6類酶中，除水解酶和連接酶外，其他酶在反應(yīng)時(shí)都需要特定的輔酶。92輔基/輔酶和維生素1.維生素的概念

脂溶性維生素：A(視黃醇)DE(生育酚)K維生素硫辛酸（氧化型）水溶性維生素：Vc（抗壞血酸）VB:B1(硫胺素)B2(核黃素)B3(泛酸)B5(PP)B12（鈷胺素）B6(吡哆醇/醛/胺）B7(生物素）硫辛酸（還原型）93942.輔基輔酶在酶促反應(yīng)中的作用

—傳遞電子、原子或某些基團(tuán)

95傳遞氫的輔基/輔酶

1.輔酶I/輔酶II及維生素PP煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/CoI）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP/CoII）

NAD+（NADP+）NAD(P)H+H++2H+,2e-2H+,2e962.黃素核苷酸和維生素B2 (1)黃素單核苷酸（FMN)(2)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)

FMN（FAD)FMNH2（FADH2)

3.維生素C（抗壞血酸）4.泛醌（輔酶Q)5.谷胱甘肽

2GSHGSSG+2H+,+2e-2H+,-2e-2H+2H++2H++2H97二.傳遞電子的輔基—鐵卟啉

Fe3+Fe2+三.轉(zhuǎn)移基團(tuán)的輔基/輔酶 1.傳遞磷酸根的輔酶—腺苷磷酸酯(ATP/ADP/AMP)

轉(zhuǎn)移磷?；鵄TP+SADP+P-S 轉(zhuǎn)移糖基ATP+糖-P

ADP-糖+PPi 轉(zhuǎn)移AMP

ATP+FMNFAD+PPi 轉(zhuǎn)移腺苷ATP+Met+H2O腺苷-Met+

PPi+Pi 能量的載體ATP+H2OADP+Pi+e-e98三.轉(zhuǎn)移基團(tuán)的輔基/輔酶 2.脫羧的輔酶—硫胺素焦磷酸（TPP)

硫胺素+ATPTPP+AMP 3.轉(zhuǎn)移?；妮o酶 （1）輔酶A和泛酸 CoA-SH+RCOOHCoA-S-COR+H2O CoA-S-COR+底物底物-COR+CoA-SH （2）硫辛酸和VB1硫胺素激酶99 4.轉(zhuǎn)移氨基的輔酶和VB6

—磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP)

AA酮酸

PCHOPCH2NH2

5.固定CO2的輔酶—生物素(VB7、VH）6.轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)的輔酶(1)四氫葉酸（FH4)(2)鈷銨素(VB12)

酮酸AA100

三、酶的作用機(jī)制酶一般是通過其活性中心，通常是其氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)先與底物形成一個(gè)中間復(fù)合物，隨后再分解成產(chǎn)物，并放出酶。酶的活性部位(activesite)是它結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個(gè)酶分子相當(dāng)小的一部分，它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體?；钚圆课煌ǔＴ诿傅谋砻婵障痘蛄芽p處，形成促進(jìn)底物結(jié)合的優(yōu)越的非極性環(huán)境。

20101酶的活性中心酶分子中的氨基酸殘基輔酶或輔助因子或它們的部分結(jié)構(gòu)酶的活性中心構(gòu)成102酶活性中心示意圖103在活性部位，底物被多重的、弱的作用力結(jié)合(靜電相互作用、氫鍵、范德華鍵、疏水相互作用)，在某些情況下被可逆的共價(jià)鍵結(jié)合。酶結(jié)合底物分子，形成酶-底物復(fù)合物(enzyme-substrate-complex)。酶活性部位的活性殘基與底物分子結(jié)合，首先將它轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài)，然后生成產(chǎn)物，釋放到溶液中。這時(shí)游離的酶與另一分子底物結(jié)合，開始它的又一次循環(huán)。104酶與底物結(jié)合的兩種模型1894年EmilFischer提出鎖和鑰匙模型(Lock-and-keyModel)，底物的形狀和酶的活性部位被認(rèn)為彼此相適合，像鑰匙插入它的鎖中[圖1-1(a)]，兩種形狀被認(rèn)為是剛性的(rigid)和固定的(fixed)，當(dāng)正確組合在一起時(shí)，正好互相補(bǔ)充。

誘導(dǎo)契合模型(induced-fitmodel)是1958年由DanielE．KoshlandJr．提出的，底物的結(jié)合在酶的活性部位誘導(dǎo)出構(gòu)象變化[圖l-l(b)]。105此外，酶可以使底物變形，迫使其構(gòu)象近似于它的過渡態(tài)。例如，葡萄糖與己糖激酶的結(jié)合，當(dāng)葡萄糖剛剛與酶結(jié)合后，即誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一種構(gòu)象變化，使活化部位與底物葡萄糖形成互補(bǔ)關(guān)系。不同的酶表現(xiàn)出兩種不同的模型特征，某些是互補(bǔ)性的，某些是構(gòu)象變化。

106鎖鑰學(xué)說107誘導(dǎo)契合學(xué)說108第三節(jié)酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)酶與化學(xué)催化劑比較具有顯著的特性。最重要的有三方面：高催化效率、強(qiáng)專一性及酶活性可以調(diào)控。22109酶催化作用的特點(diǎn)加快反應(yīng)速度降低反應(yīng)的活化能不改變反應(yīng)性質(zhì)反應(yīng)前后其數(shù)量和性質(zhì)不變催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制共性特性酶催化作用的特點(diǎn)110一、催化能力

酶加快反應(yīng)速度可高達(dá)1017倍(如OMP脫羧酶)。但酶催化反應(yīng)速度和在相同pH及溫度條件下非酶催化反應(yīng)速度的可直接比較的例子很少，這是因?yàn)榉敲复呋姆磻?yīng)速度太低，不易觀察。對那些可比較的反應(yīng)，可發(fā)現(xiàn)反應(yīng)速度大大加速(見下例)。23111極高的催化效率2H2O22H2O+O2Fe2+作為催化劑催化效率為6×10-4mol/(mol.s)過氧化氫酶，催化效率為6×106mol/(mol.s)過氧化氫酶比Fe2+的催化效率要高出1010倍酶的催化效率相對其他無機(jī)或有機(jī)催化劑要高106~1013倍例子112例如:如乙酰膽堿酯酶接近l013倍，丙糖磷酸異構(gòu)酶為109倍，分支酸變位酶為1.9X106倍，四膜蟲核酶接近1011倍(表1-6)。在其他可比較的反應(yīng)中，酶促反應(yīng)速度相當(dāng)高，而反應(yīng)溫度可能很低。酶催化的最適條件幾乎都為溫和的溫度和非極端pH。以固氮酶為例，NH3的合成在植物中通常是25℃和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由兩個(gè)解離的蛋白質(zhì)組分組成的一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其中一個(gè)含金屬鐵，另一個(gè)含鐵和鉬，反應(yīng)需消耗一些ATP分子，精確的計(jì)量關(guān)系還未知。但工業(yè)上由氮和氫合成氨時(shí)，需在溫度700～900K，壓力10～90MPa下，還要有鐵及其他微量金屬氧化物作催化劑才能完全反應(yīng)。113++++++++++++++++++++++24返回114二、專一性115高度專一性酶對它所作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種酶只能催化某一類，甚至是某一種物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)酶的專一性底物專一性反應(yīng)專一性立體異構(gòu)專一性(手性、區(qū)域)從根本上保證了生物體內(nèi)為數(shù)眾多的各種各樣的化學(xué)反應(yīng)能有條不紊地協(xié)同進(jìn)行116

大多數(shù)酶對所作用的底物和催化的反應(yīng)都是高度專一的。不同的酶專一性程度不同，有些酶專一性很低(鍵專一性)，如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶，可以作用很多底物，只要求化學(xué)鍵相同。例如它們可分別作用肽、磷酸酯、羧酸酯。生物分子降解中常見到低專一性的酶，而在合成中則很少見到，這是因?yàn)榍罢呤瞧鸾到庾饔茫蛯Ｒ恍钥赡芨鼮榻?jīng)濟(jì)。25

117具有中等程度專一性的為基團(tuán)專一性，如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化。大多數(shù)酶呈絕對或幾乎絕對的專一性，它們只催化一種底物進(jìn)行快速反應(yīng)，如脲酶只催化尿素的反應(yīng)或以很低的速度催化結(jié)構(gòu)非常相似的類似物。118基團(tuán)專一性和絕對專一性對低分子量的底物來說容易理解。對大分子底物而言，由于酶的活性中心只與大分子的一部分相互作用，因此情形有點(diǎn)不同，限制性核酸內(nèi)切酶一般可識別DNA上4～6對堿基，然后切除雙鏈間的磷酸二酯鍵，一般切成粘性末端?，F(xiàn)已知道有400多種不同專一性的這類酶，雖然酶對含有合適序列的任何DNA分子或片段都能作用，但每一個(gè)酶的活性中心接觸底物的特定區(qū)域具有絕對的專一性。119立體專一性酶的另一個(gè)顯著特點(diǎn)就是催化反應(yīng)的立體專一性。以NAD+和NADP+為輔因子的脫氫酶為例，用適當(dāng)標(biāo)記的底物做實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脫氫酶催化底物上的氫轉(zhuǎn)移到尼克酰胺環(huán)特異的一面，稱為A型脫氫酶和B型脫氫酶(圖1-5)。幾乎所有的脫氫酶作用時(shí)都需要NAD+或NADP+。對那些已知立體結(jié)構(gòu)的脫氫酶，如肝乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，其專一性機(jī)制已經(jīng)搞清。120121潛手性在酶催化反應(yīng)中，還存在潛手性例子，雖然底物本身不具有手性，但反應(yīng)卻是立體專一性的。以延胡索酸水合酶催化延胡索酸生成蘋果酸為例，在3H20溶液中，3H以立體專一性方式加入到底物上(圖1-6)。122潛手性專一性？大多數(shù)脫氫酶對尼克酰胺核苷酸輔酶NAI(P)+或者NAD(P)H中的尼克酰胺環(huán)第四位碳原子(C-4)上的兩個(gè)氫表現(xiàn)特殊的立體專一性，稱為潛手性(prochirality)專一性。雖然尼克酰胺環(huán)上的C-4既非不對稱碳，也非順反異構(gòu)特征，但脫氫酶卻都能專一地識別并作用這個(gè)碳原子上兩個(gè)氫中的一個(gè)。正因?yàn)檫@個(gè)原故，以尼克酰胺核苷酸為輔酶的脫氫酶可以此分為A，B兩型，如圖1-5(A)；潛手性專一性也可在脫氫酶以外的其他酶反應(yīng)中觀察到。123高度專一性酶催化專一性作用機(jī)制假說鎖鑰假說誘導(dǎo)契合假說124三、調(diào)節(jié)性生命現(xiàn)象表現(xiàn)了它內(nèi)部反應(yīng)歷程的有序性。這種有序性是受多方面因素調(diào)節(jié)和控制的而酶活性的控制又是代謝調(diào)節(jié)作用的主要方式。酶活性的調(diào)節(jié)控制主要有下列7種方式。271．酶濃度的調(diào)節(jié)

酶濃度的調(diào)節(jié)主要有兩種方式：一種是誘導(dǎo)或抑制酶的合成；一種是調(diào)節(jié)酶的降解。例如，在分解代謝中，β-半乳糖苷酶的合成，平時(shí)是處于被阻遏狀態(tài)，當(dāng)乳糖存在時(shí)，抵消了阻遏作用，于是酶受乳糖的誘導(dǎo)而合成。

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2.激素調(diào)節(jié)激素調(diào)節(jié)也和生物合成有關(guān)，但調(diào)節(jié)方式有所不同。如乳糖合成酶有兩個(gè)亞基，催化亞基和修飾亞基。催化亞基本身不能合成乳糖，但可以催化半乳糖以共價(jià)鍵的方式連接到蛋白上形成糖蛋白。修飾亞基和催化亞基結(jié)合后，改變了催化亞基的專一性，可以催化半乳糖和葡萄糖反應(yīng)生成乳糖。修飾亞基的水平是由激素控制的。妊娠時(shí)，修飾亞基在乳腺生成，分娩時(shí)，由于激素水平急劇的變化，修飾亞基大量合成，它和催化亞基結(jié)合，大量合成乳糖。1263．共價(jià)修飾調(diào)節(jié)

共價(jià)修飾這種調(diào)節(jié)方式本身又是通過酶催化進(jìn)行的。在一種酶分子上，共價(jià)地引入一個(gè)基團(tuán)從而改變它的活性。引入的基團(tuán)又可以被第三種酶催化除去。例如，磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化；大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化就是以這種方式調(diào)節(jié)它們的活性。28

1274．限制性蛋白水解作用與酶活力調(diào)控限制性蛋白酶水解是一種高特異性的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)系統(tǒng)。細(xì)胞內(nèi)合成的新生肽大都以無活性的前體形式存在，一旦生理需要，才通過限制性水解作用使前體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘牡鞍踪|(zhì)或酶，從而啟動(dòng)和激活以下各種生理功能，如酶原激活、血液凝固、補(bǔ)體激活等。除了參與酶活性調(diào)控外，還起著切除、修飾、加工等作用，因而具有重要的生物學(xué)意義。128酶原激活酶原激活是指體內(nèi)合成的非活化的酶前體，在適當(dāng)條件下，受到H+或特異的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或斷開酶原分子上某個(gè)肽鍵而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘拿浮Ｈ缫鹊鞍酌冈谛∧c里被其他蛋白水解酶限制性地切去一個(gè)六肽，活化成為胰蛋白酶。129血液凝固血液凝固是由體內(nèi)十幾種蛋白質(zhì)因子參加的級聯(lián)式酶促激活反應(yīng)，其中大部分為限制性蛋白水解酶。在凝血過程中首先由蛋白質(zhì)因子(稱為因子xa的蛋白酶)激活凝血酶原，生成活性凝血酶；并由它再催化可溶性的纖維蛋白原，轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白，聚集成網(wǎng)狀細(xì)絲，以網(wǎng)住血液的各種成分。在凝血酶作用下，收縮成血塊，使破損的血管封閉而修復(fù)。130補(bǔ)體補(bǔ)體是一類血漿蛋白，和免疫球蛋白一樣發(fā)揮防御功能。免疫球蛋白對外來異物有“識別”結(jié)合作用和激活補(bǔ)體作用。補(bǔ)體是一組蛋白酶(由11種蛋白組分組成)，通常非活性前體形式存在于血清中，一旦接受到Ig(免疫球蛋白)傳來的抗原入侵信號，被限制性蛋白酶水解而激活補(bǔ)體組分，最終形成“攻膜復(fù)合物”執(zhí)行其功能。131

5．抑制劑的調(diào)節(jié)

酶的活性受到大分子抑制劑或小分子抑制劑抑制，從而影響活力。前者如胰臟的胰蛋白酶抑制劑(抑制酶)；后者如2,3-二磷酸甘油酸，是磷酸變位酶的抑制劑。30。1326．反饋調(diào)節(jié)許多小分子物質(zhì)的合成是由一連串的反應(yīng)組成的。催化此物質(zhì)生成的第一步反應(yīng)的酶，往往可以被它的終端產(chǎn)物所抑制，這種對自我合成的抑制叫反饋抑制。這在生物合成中是常見的現(xiàn)象。例如，異亮氨酸可抑制其合成代謝通路中的第一個(gè)酶——蘇氨酸脫氨酶。當(dāng)異亮氨酸的濃度降低到一定水平時(shí)，抑制作用解除，合成反應(yīng)又重新開始。再如合成嘧啶核苷酸時(shí)．終端產(chǎn)物UTP(尿苷三磷酸)和CTP(胞苷三磷酸)可以控制合成過程一連串反應(yīng)中的第一個(gè)酶。反饋抑制就是通過這種調(diào)節(jié)控制方式，調(diào)節(jié)代謝物流向，從而調(diào)節(jié)生物合成1337．金屬離子和其他小分子化合物的調(diào)節(jié)有一些酶需要K+活化，NH4+往往可以代替K+，但Na+不能活化這些酶，有時(shí)還有抑制作用，這一類酶有L-高絲氨酸脫氫酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸激酶和酵母丙酮酸羧化酶。另一些酶需要Na+活化，K+起抑制作用，如腸中的蔗糖酶可受Na+激活，二價(jià)金屬離子如Ca2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+往往也為一些酶表現(xiàn)活力所必需，它們的調(diào)節(jié)作用還不很清楚，可能和維持酶分子一定的三級、四級結(jié)構(gòu)有關(guān)，有的則和底物的結(jié)合和催化反應(yīng)有關(guān)。這些離子的濃度變化都會(huì)影響有關(guān)的酶活力。31134能荷的數(shù)值是0～1，當(dāng)腺苷酸全部以AMP的形式存在時(shí)，能荷數(shù)值等于0；全部以ATP形式存在，能荷數(shù)值等于1。細(xì)胞內(nèi)的能荷數(shù)值一般在0.8～0.9之間，在這個(gè)范圍內(nèi)，能荷數(shù)值的增加可使和ATP再生有關(guān)的酶(如糖磷酸激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和檸檬酸合成酶等)的反應(yīng)速度降低；而使另一類和利用ATP有關(guān)的酶(天冬氨酸激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等)的反應(yīng)速度增加。此外，酶的區(qū)室化(compartmentationn)和多酶復(fù)合體等都和酶活力的調(diào)節(jié)控制有密切關(guān)系。32135第四節(jié)影響酶活力的因素一.酶的測定33酶蛋白的存在量可以根據(jù)它催化所產(chǎn)生的效應(yīng)即把底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物來進(jìn)行測定。為了測定酶(檢測酶的活性)必須了解催化反應(yīng)總的反應(yīng)式，而且分析程序必須能夠測定底物的消失或產(chǎn)物的生成。此外，還必須考慮酶是否需要某種輔助因子(cofactor)，酶的最適pH、最適溫度。對哺乳動(dòng)物的酶，最適溫度通常在25～37℃。最后，測定的反應(yīng)速率是酶的活性，它必須不受底物供應(yīng)不充分的限制。因此，一般要求非常高的底物濃度以使實(shí)驗(yàn)測定的起始反應(yīng)速率與酶濃度成正比。

136酶最方便的測定是測量產(chǎn)物出現(xiàn)的速率或底物的消失速率。

如果底物(或產(chǎn)物)在特殊波長下吸收光，根據(jù)它們在此波長下吸收光的變化即可測得這些分子的濃度變化。這可用分光光度計(jì)(spectrophotometer)來完成。因?yàn)楣馕张c濃度成正比例，光吸收改變的速率與酶活力，即每單位時(shí)間底物用去的物質(zhì)的量(或產(chǎn)物形成的物質(zhì)的量)成正比。137最常用的分子：在酶測定中利用吸收光測量的兩個(gè)最常用的分子是還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NDPH)。它們在紫外光(UV)區(qū)的吸收波長為340nm，因此，如果NADH或NADPH在反應(yīng)過程中產(chǎn)生，那么在340nm的光吸收將相應(yīng)地增加。如果，當(dāng)反應(yīng)是NADH或NADPH分別氧化為NAD+或NADP+時(shí)，吸收將會(huì)相應(yīng)地降低，因?yàn)樗鼈兊难趸驮诓ㄩL340nm處不吸收光。一個(gè)實(shí)例是乳酸脫氫酶，以乳酸作為底物的活力可依據(jù)下示方程，用隨之增加的340nm的光吸收進(jìn)行測定。34138二、酶聯(lián)測定法許多反應(yīng)，它們吸收光的適合波長不包括底物和產(chǎn)物。在這種情況下測定催化此反應(yīng)的酶，將其與第二個(gè)具有特殊吸收光變化的酶反應(yīng)相連接(linking)(或偶聯(lián)coupling)，通常是可行的。例如，利用葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)的作用，可經(jīng)常用于測量糖尿病人血液中葡萄糖的濃度，由底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物不造成吸收光的變化。但是，在此反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫能被第二種酶——過氧化物酶作用，并把一個(gè)無色化合物轉(zhuǎn)化為有色化合物——色素原(chromogen)，它的光吸收能容易地進(jìn)行測量。35如要對第一個(gè)酶(葡萄糖氧化酶)的活力作精確的測量，第二個(gè)酶(過氧化物酶)和它的共底物或輔酶必須過量，使酶聯(lián)測定不屬限速步驟。這可保證有色色素原的產(chǎn)生速率與H2O2的產(chǎn)生速率成正比，它的產(chǎn)生又與葡萄糖氧化酶的活力成正比。139三、酶速度

酶催化反應(yīng)的速率通常稱作酶速度(velocity)。酶速度通常記錄為時(shí)間為零時(shí)的值(V。，單位為μmol／min)，因?yàn)楫a(chǎn)物尚未出現(xiàn)，在這點(diǎn)上速率是最快的。這是因?yàn)樵谌魏蔚孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物之前底物濃度是最大的。還因?yàn)槊缚赡苁艿剿旧懋a(chǎn)物的反饋抑制(feedbackinhibition)和/或包括逆反應(yīng)，而且反應(yīng)產(chǎn)物將刺激逆反應(yīng)。36，140酶促反應(yīng)形成的產(chǎn)物對時(shí)間的典型的圖表明：產(chǎn)物迅速形成的起始期，構(gòu)成圖形的線性部分(圖1-7)，隨后，酶速度緩慢下降，因?yàn)榈孜镆延帽M和/或酶失去活力；Vo的獲得是以零時(shí)點(diǎn)(time-point)為起點(diǎn)作一與曲線的線性部分相切的直線，這一直線的斜率即等于Vo。141酶活力單位(enzymeunits)可以用許多方式表示。最普通的是被催化的反應(yīng)的起始速度(Vo)(如每分鐘底物轉(zhuǎn)換的物質(zhì)的量，單位為μmol／min)。也有兩種酶活力的標(biāo)準(zhǔn)單位，即：酶單位(U)和“開特”(kat)。酶的1個(gè)活力單位是在該酶的最適條件下，在25℃，1min內(nèi)催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量?！伴_特”是酶活力的國際單位(sⅠ)，它規(guī)定在特定體系下，反應(yīng)速度為每秒轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。在兩種不同的酶活力單位之間可用lμmol／min＝lU＝16.67nkat換算。37142酶活力(或總活力)涉及在樣品中酶的總單位。比活力是每毫克蛋白質(zhì)中酶單位的數(shù)量(U／mg)。比活力是酶純度的量度，在酶的純化過程中它的比活力增高，當(dāng)酶提純時(shí)，其比活力值成為極大和恒定。143四、底物濃度

酶速度對底物濃度([S])的依賴關(guān)系的正常模式是，在低的底物濃度下，[S]增加1倍，將導(dǎo)致起始速度(Vo)也增加1倍。然而，在較高底物濃度下，酶被飽和(saturated),進(jìn)一步增高[S]，只導(dǎo)致V。的微小變化。這是因?yàn)樵谟行У娘柡偷孜餄舛认?，所有酶分子已有效地與底物結(jié)合，這時(shí)，總的酶速度依賴于產(chǎn)物自酶解離下的速率，若進(jìn)一步加入底物對酶速度也將不發(fā)生影響。V。對[S]的關(guān)系圖形稱為雙曲線(hyperboliccurve)(圖l-8)。38144五、酶濃度

在底物濃度飽和的情況下(即所有酶分子都與底物結(jié)合)，酶濃度的加倍將導(dǎo)致V。的加倍。Vo與酶濃度的關(guān)系圖為直線圖形。39145六、溫度

溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)的速率。首先，升高溫度增加底物分子的熱能(thermalenergy)，增高反應(yīng)的速率。然而較高溫度會(huì)帶來第二種效應(yīng)，增加構(gòu)成酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能，也就增加了多重弱的非共價(jià)鍵相互作用(氫鍵、范德華引力等)破裂的機(jī)會(huì)。這些相互作用維系著整個(gè)酶的三維結(jié)構(gòu)，最終將導(dǎo)致酶的變性(伸展unfolding)。酶的三維構(gòu)象甚至微小的變化都會(huì)改變活性部位的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化活性的降低。40146升高溫度以提高反應(yīng)速率的總效應(yīng)是這兩個(gè)相反效應(yīng)之間的平衡。因此溫度對Vo關(guān)系的圖形將為一條曲線，它可清楚地表示出最適溫度[圖1-9(a)]。多數(shù)哺乳動(dòng)物的酶，其最適溫度為37℃左右，但也有些生物機(jī)體的兩適應(yīng)在相當(dāng)高或相當(dāng)?shù)蜏囟认鹿ぷ鳌＠?，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的Taq聚合酶(Taqpolymerase)是在溫泉中、生活在高溫下的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，因此適于在高溫下工作。147七、pH每個(gè)酶都有最適pH，在此pH下催化反應(yīng)的速率是它的最高值。最適pH的微小偏離，由于使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化而降低酶的活力。pH發(fā)生較大偏離時(shí)，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價(jià)鍵受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白自身的變性。Vo對pH的關(guān)系圖形通常將得到鐘形曲線[圖1-9(b)]。41返回148許多酶的最適pH在6.8左右，但是各種酶的最適pH是多種多樣的，因?yàn)樗鼈円m應(yīng)不同環(huán)境進(jìn)行工作。例如，消化酶胃蛋白酶(pepsin)要適應(yīng)在胃的酸性pH下工作(大約pH2.0)。149第五節(jié)酶動(dòng)力學(xué)和抑制作用一、米-曼氏模式42

米—曼氏模式(Mchaelis-Mentontonmodel)使用如下的酶催化概念：這里速率常數(shù)(rateconstants)k1、k2和k3是描述與催化過程的每一步相聯(lián)系的反應(yīng)速度。150酶-底物復(fù)合物酶(E)與它的底物(S)結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物(ES)。ES復(fù)合物能重新解離形成E+S，或能繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)形成E和產(chǎn)物P。假設(shè)：酶與產(chǎn)物(E+P)的逆向反應(yīng)形成ES復(fù)合物的速率并不明顯。對許多酶的性質(zhì)的觀察得知，在低的底物濃度[S]下，起始速度(Vo)直接與[S]成正比，而在高底物濃度[S]下，速度趨向于最大值，此時(shí)反應(yīng)速率與[S]無關(guān)[圖l-10(a)]。此最大速度(maximumvelocity)稱為Vmax(單位為μmol／min)。15143返回42米-曼氏推導(dǎo)的公式描述出實(shí)驗(yàn)觀察的結(jié)果。米-曼氏公式如下：此公式描述的雙曲線形式，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在圖l-10(a)中表明。Micha