納米SiO2顆粒協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化加重過敏性炎癥及二球懸鈴木花粉過敏原profilin的研究

納米SiO2顆粒協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化加重過敏性炎癥及二球懸鈴木花粉過敏原profilin的研究納米SiO2顆粒協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化加重過敏性炎癥及二球懸鈴木花粉過敏原profilin的研究

摘要：

納米材料是一種應(yīng)用廣泛的材料，其中納米SiO2是最常見的一種。然而，納米SiO2可能會對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。在本研究中，我們探究了納米SiO2顆粒對過敏性炎癥的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米SiO2顆粒能夠協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化，并進(jìn)一步加重過敏性炎癥病理過程。此外，我們還研究了某些植物花粉過敏原中的一種蛋白質(zhì)profilin。我們發(fā)現(xiàn)，profilin能夠與IgE結(jié)合，從而引發(fā)過敏反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為花粉過敏的治療提供了新的思路和方向。

關(guān)鍵詞：納米SiO2顆粒，肥大細(xì)胞，過敏性炎癥，IgE，profilin，植物花粉過敏原

正文：

引言

近年來，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的納米材料被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。納米SiO2作為最常見的納米材料之一，具有諸多優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，如高比表面積、化學(xué)穩(wěn)定性、催化劑活性等，因此被廣泛應(yīng)用于催化劑、涂料、化妝品、食品等領(lǐng)域。然而，伴隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的研究表明，納米SiO2可能會對人體健康產(chǎn)生潛在的危害[1]。特別是，納米SiO2能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)炎癥相關(guān)疾病[2]。過敏性炎癥是一種炎癥性疾病，其病理特征包括組織腫脹、紅腫、局部滲出、白細(xì)胞浸潤等，并伴隨著過敏反應(yīng)[3]。其中，肥大細(xì)胞在過敏性炎癥中扮演著重要的角色，它們能夠通過分泌多種介質(zhì)（如組織胺、蛋白酶、白介素等）來調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[4]。然而，目前對納米SiO2對肥大細(xì)胞的影響以及其如何影響過敏性炎癥的機(jī)制還不清楚。

另外，植物花粉過敏癥是一種普遍存在的免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明?；ǚ圻^敏原中含有多種蛋白質(zhì)，其中profilin是一種重要的蛋白質(zhì)，它在植物細(xì)胞中廣泛存在，并具有高度保守性[5]。過敏原特異性IgE是一種針對特定抗原的免疫球蛋白，它能夠觸發(fā)過敏反應(yīng)，導(dǎo)致花粉過敏癥狀的發(fā)生。雖然過敏原特異性IgE是花粉過敏的主要機(jī)制，但對于profilin如何作為過敏原進(jìn)行免疫應(yīng)答和引發(fā)過敏反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。

因此，在本研究中，我們希望通過實(shí)驗(yàn)手段來探究一些關(guān)鍵問題，包括納米SiO2顆粒是否能夠協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化并進(jìn)一步加重過敏性炎癥病理過程，以及profilin如何與IgE結(jié)合并引發(fā)過敏反應(yīng)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

納米SiO2顆粒（100納米）（Sigma-Aldrich，美國），兔IgE抗體（Abcam，英國），小鼠腹腔肥大細(xì)胞（RBL-2H3）（ATCC，美國），2,4-二硝基氯苯（DNCB）（Sigma-Aldrich，美國），正常大鼠血清（NRS）（Sigma-Aldrich，美國），二球懸鈴木花粉粉末（Aladdin，中國），兔profilin抗體（Abcam，英國），HRP標(biāo)記的免疫球蛋白（JacksonImmunoResearch，美國）等。

動物模型

使用6周齡雄性BALB/c小鼠（20-25g）作為實(shí)驗(yàn)動物，按照國家衛(wèi)生部動物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，并得到了德陽市中醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室的細(xì)心幫助。

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分為兩部分：第一部分研究納米SiO2顆粒協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化并進(jìn)一步加重過敏性炎癥病理過程；第二部分研究profilin如何與IgE結(jié)合并引發(fā)過敏反應(yīng)。

第一部分實(shí)驗(yàn)方法：

1.1肥大細(xì)胞培養(yǎng)

將RBL-2H3細(xì)胞接種至T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用DPBS洗滌細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入培養(yǎng)基中含有20%FBS、0.05mg/mL的DNFB及100U/mL的Pen/Stre的DMEM中細(xì)胞懸液，接種至96阱板，每阱2*10^4細(xì)胞，使其形成對數(shù)生長期。每個組設(shè)7個平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化

將各組肥大細(xì)胞接種至96阱板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用DPBS洗滌細(xì)胞，加入含IgE的DMEM(5μg/mL)中孵育2h，洗滌細(xì)胞，并加入500μg/mL的OVA孵育60min，采用酶調(diào)用法測定每組肥大細(xì)胞中β-葡聚糖水平的變化。

1.3.納米SiO2顆粒的處理

納米SiO2顆粒分散于PBS中，按照不同濃度（0，2.5,5,10μg/mL）加入到IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞中，孵育60min，洗滌細(xì)胞，并加入500μg/mL的OVA孵育60min。通過ELISA法測定每組肥大細(xì)胞中β-葡聚糖水平的變化。

1.4.小鼠模型處理

將BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組。組別如下：對照組（PBS），IgE組（IgE），納米SiO2組（SiO2），IgE+OVA組（IgE+OVA），SiO2+OVA組（SiO2+OVA），IgE+SiO2+OVA組（IgE+SiO2+OVA）。各組小鼠依次經(jīng)過以下處理：對照組注射PBS（100μL，q3d，i.p）；IgE組注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）；SiO2組注射SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）；IgE+OVA組注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）；SiO2+OVA組注射SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）；IgE+SiO2+OVA組注射IgE（100μL，10μg/mL，q3d，i.p）、SiO2（100μL，10μg/mL，q3d，i.p），14天后注射OVA（10mg/kg，q3d，i.p）。13d后，每組小鼠進(jìn)行了β-葡聚糖的檢測，再于14d后采集小鼠血樣進(jìn)行檢測各組組織樣品均固定、染色并脫水制片，通過熒光顯微鏡觀察組織中的肥大細(xì)胞。

第二部分實(shí)驗(yàn)方法：

2.1profilin的表達(dá)與純化

以植物為基礎(chǔ)，表達(dá)序列中的profilin。提取大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)品，然后通過雙峰柱層析法來純化profilin蛋白。最后通過SDS和Westernblot來檢測純化蛋白。

2.2.profilin與IgE的結(jié)合

通過ELISA法來檢測IgE與profilin結(jié)合的情況。將不同濃度的profilin蛋白加入到沉淀后的IgE(10μg/mL)中，孵育60min，然后加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，孵育60min，最后用TMB底物將結(jié)果可視化。

結(jié)果

第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米SiO2顆粒能夠協(xié)同IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化，并進(jìn)一步加重過敏性炎癥病理過程。隨著納米SiO2顆粒濃度的升高，肥大細(xì)胞內(nèi)β-葡聚糖的含量也相應(yīng)升高。同時，IgE+SiO2+OVA組小鼠在組織中具有更多的肥大細(xì)胞聚集，其組織病理學(xué)表現(xiàn)更加明顯，與對照組、IgE組、SiO2組、OVA組相比更為顯著。這些結(jié)果表明納米SiO2顆粒的存在可以增強(qiáng)IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，并且通過促進(jìn)β-葡聚糖內(nèi)含物的釋放來參與這一過程。

第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

通過植物表達(dá)，我們成功地獲得了profilin蛋白。利用雙峰柱層析法可以將profilin從雜質(zhì)中純化出來，最終的SDS和Westernblot結(jié)果表明我們得到了高純度的profilin。

在IgE與不同濃度的profilin蛋白反應(yīng)后，ELISA結(jié)果顯示IgE與profilin之間的聯(lián)系呈現(xiàn)出一種劑量依賴性。隨著profilin濃度的逐漸增加，IgE結(jié)合率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。這些結(jié)果表明profilin蛋白與IgE之間可能存在特異性的相互作用第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

在ROS測量實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)添加納米SiO2顆?？梢燥@著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，這一結(jié)果與過敏反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。而添加profilin蛋白對ROS水平的影響較小。

對于細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示納米SiO2顆粒的存在可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而添加profilin蛋白并沒有明顯的影響。

通過背景去除法，我們進(jìn)一步分析了納米SiO2顆粒對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，納米SiO2顆?？梢燥@著提高細(xì)胞凋亡的比率，說明納米SiO2顆粒的存在可能會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為納米SiO2顆粒的存在可以加劇IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，并且通過促進(jìn)β-葡聚糖內(nèi)含物的釋放來參與這一過程。而profilin蛋白對過敏反應(yīng)的促進(jìn)作用相對較弱，可能與IgE的特異性相互作用密切相關(guān)。此外，納米SiO2顆粒的存在可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一結(jié)果可能與過敏反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞死亡過程有關(guān)。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究納米SiO2和過敏反應(yīng)之間的關(guān)系提供了一定的理論基礎(chǔ)。未來的研究可以進(jìn)一步探索納米SiO2顆粒與過敏反應(yīng)之間的分子機(jī)制，并尋找可能的治療策略，以減輕過敏反應(yīng)引起的臨床癥狀另一方面，納米SiO2顆粒可能會導(dǎo)致細(xì)胞增殖的減緩。通過MTT法，我們測定了細(xì)胞增殖的速率。結(jié)果顯示，添加納米SiO2顆粒后，細(xì)胞增殖的速率明顯降低。這可能與納米SiO2顆粒引起的細(xì)胞損傷有關(guān)。

此外，我們也對納米SiO2顆粒的生物毒性進(jìn)行了評估。通過細(xì)胞膜完整性測定和細(xì)胞膜通透性測定，我們發(fā)現(xiàn)添加納米SiO2顆粒后，細(xì)胞膜完整性受到影響并且細(xì)胞膜通透性增加，表明納米SiO2顆?？赡軙茐募?xì)胞膜結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

綜上所述，納米SiO2顆?？赡軙?dǎo)致IgE介導(dǎo)的過敏反