第三章凝膠分離技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：1、凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和，產(chǎn)物收率高，重現(xiàn)性好；2、應(yīng)用范圍廣，所分離物質(zhì)分子量覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬(wàn)分子量的物質(zhì)；3、設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，周期短，可反復(fù)使用。凝膠分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶、核酸、激素、多糖等）的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五第一節(jié)凝膠分離原理一、凝膠分離原理當(dāng)被分離物質(zhì)的分子大小不同時(shí)，能夠進(jìn)入到凝膠內(nèi)部的能力也不同。凝膠中的孔隙大小與分子大小有相仿的數(shù)量級(jí)。當(dāng)混合物通過(guò)凝膠時(shí)，比孔隙小的分子可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比孔隙大的分子就不能進(jìn)入，因此在移動(dòng)速度方面就出現(xiàn)差異，從而使不同相對(duì)分子質(zhì)量的各組分得到分離?，F(xiàn)在是2頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五分離原理可用下式表示：VR=V0+kVi式中：VR：保留體積（洗脫體積）V0：柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積——外水體積Vi：凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積——內(nèi)水體積k：分配系數(shù)現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五被分離物質(zhì)分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外：k=0，VR=V0；被分離物質(zhì)分子很小，能完全自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部：k=1，VR=V0+Vi；中等大小的分子，只能達(dá)到部分凝膠顆粒內(nèi)部：0＜k＜1，V0＜VR＜V0+Vi?，F(xiàn)在是6頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五Vo、Vi的測(cè)定①Vo的測(cè)定

選用分子量約200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖-2000（或一種不被凝膠滯留的有顏色的大分子物質(zhì)，便于觀察)，測(cè)定它的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的Vo值。②Vi的測(cè)定選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測(cè)出其洗脫體積，減去Vo就是該柱的Vi。常用鉻酸鉀(黃色)或有UV吸收的物質(zhì)如N-乙酰酪氨酸乙酯來(lái)測(cè)定。現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五分配系數(shù)k的計(jì)算：k=（VR-V0）/Vi現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五分子量與洗脫體積的關(guān)系：lgMr=-k`VR+Vo（成立？）Mr很大時(shí)，達(dá)到上限？Mr很小時(shí)，達(dá)到下限？現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五二、常用凝膠葡聚糖凝膠(dextrangel，Sephadex)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel，Bio-GelP)瓊脂糖凝膠(agarosegel，Sepharose)瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠(Superdex)此外還有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝膠現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五1、葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亞楓等溶劑中都可吸液膨脹,但吸收溶劑的量與膨脹后的體積視溶劑而異。凝膠充分膨脹的時(shí)間隨交聯(lián)度而不同,交聯(lián)度越小所需時(shí)間越長(zhǎng),加熱可以縮短吸水膨脹時(shí)間?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五葡聚糖和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚鍵相互交聯(lián)形成。按交聯(lián)度大小分8種型號(hào)，G值代表不同交聯(lián)度。SephadexG-10，15，25，50，75，100，150，200數(shù)字表示每克干膠膨脹時(shí)吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干膠膨脹時(shí)可以吸水2.5克。現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五葡聚糖凝膠現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五葡聚糖凝膠只能應(yīng)用于水溶性物質(zhì)與水溶液或類水溶液,但如在葡聚糖分子上引入有機(jī)基團(tuán)則可以增大其有機(jī)性質(zhì)而使之呈親脂性。如LH-20型葡聚糖凝膠即為在G-25型凝膠上引入羥丙基基團(tuán),使糖分子與醚鏈相連。這種凝膠既有親水性,又有親脂性,可以在多種有機(jī)溶劑中膨脹后應(yīng)用,如氯仿、丁醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)等,但在苯、乙酸乙酯等溶劑中膨脹不多,較少應(yīng)用。用氯仿時(shí),因凝膠比重較小,所以要采取措施,使凝膠不能浮起,也可改用上行法。現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五2、聚丙烯酰胺凝膠現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五3、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠與前二種不同,它不是以化學(xué)鍵共價(jià)鍵交聯(lián)的,而是以氫鍵交聯(lián),不同的孔隙程度是由改變瓊脂糖的濃度而達(dá)到的,因此穩(wěn)定性有一定限制。沒(méi)有干的凝膠,必須在膨脹狀態(tài)保存,遇脫水劑、冷凍和有機(jī)溶劑即破壞。pH在4-9之間、溫度在0-40℃之間穩(wěn)定,超出此范圍即破壞?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五三、凝膠特性參數(shù)1、排阻極限：指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量，即相對(duì)分子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，其洗脫體積為Vo。如SephadexG50的排阻極限為30000。2、分級(jí)范圍：即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。如SephadexG50的分級(jí)范圍為1500-30000?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五3、凝膠粒徑：凝膠一般為球形，其粒徑越小，HETP（理論板當(dāng)量高度）越小，分辨率越高。凝膠粒徑多用篩目或微米表示。如軟粒凝膠一般為50-150微米（100-300目），硬粒凝膠一般為5-50微米。4、空隙體積：指柱中凝膠之間空隙的體積，即Vo?？障扼w積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測(cè)定，如相對(duì)分子質(zhì)量為200萬(wàn)的水溶性藍(lán)色葡聚糖?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五5、溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)稱為溶脹率，即溶脹率=×100%如SephadexG50的溶脹率為500%±30%。6、床體積：指1克干膠充分溶脹后所占有的體積。如SephadexG50的床體積為9-11mL/g干膠。凝膠的床體積可用于估算裝滿一定體積的凝膠柱所需的凝膠干粉量。

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五第二節(jié)凝膠分離應(yīng)用凝膠分離特點(diǎn)(1)溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生相互作用，操作條件溫和，回收率可接近100%；(2)批次之間不需要進(jìn)行苛刻的介質(zhì)清洗或再生，容易實(shí)現(xiàn)循環(huán)操作；(3)分離機(jī)理簡(jiǎn)單、操作參數(shù)少、容易規(guī)模放大；(4)僅根據(jù)分子量進(jìn)行分離，選擇性較低，處理量小。現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五一、凝膠的選擇與處理1、排阻范圍的選擇現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五2、粒度的選擇現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五3、凝膠用量的選擇

干凝膠用量（g）：πr2h/床體積理論用量×（1+10%）=凝膠處理量現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五4、凝膠的處理（1）除去影響流速的過(guò)細(xì)顆粒

“水力浮洗法”：將顆粒粗細(xì)不均的凝膠懸浮在大體積的水中，讓它自然沉降，過(guò)細(xì)的顆粒浮在上面，倒去即可。反復(fù)幾次。（2）溶脹使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。通常使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫到近沸，1~2小時(shí)即可。

沸水溶脹不但節(jié)省時(shí)間，還可以殺滅凝膠中污染的細(xì)菌并排除氣體?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五（3）為了保證流速穩(wěn)定，獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用前用傾瀉法傾去不易沉下的較細(xì)顆粒，使凝膠顆粒大小一致?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五5、柱結(jié)構(gòu)（φ、h）的選擇現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五柱太短，影響分離效果；柱長(zhǎng)一些，分離效果好，但柱太長(zhǎng)，則延長(zhǎng)分離時(shí)間，樣品也稀釋過(guò)度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)：內(nèi)徑過(guò)細(xì)（小于1cm），會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果；過(guò)大（大于5cm）則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例：對(duì)于除鹽來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰5～1︰25；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰20～1︰100?，F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五二、凝膠分離操作技術(shù)1、凝膠裝柱①將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊；②向柱中加入約1/3體積的0.9％NaCl溶液（或洗脫液）；③將一細(xì)玻棒伸入柱內(nèi)，靠近管內(nèi)壁，順著玻棒緩慢的向管內(nèi)加入混勻的凝膠溶液；2·min。⑤連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管口約5cm處。注意：防止空氣進(jìn)入凝膠床現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五裝柱操作注意事項(xiàng)：灌注凝膠時(shí)要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時(shí)斷時(shí)續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已經(jīng)形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的地方，再繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好凝膠后才發(fā)現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時(shí)，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時(shí)，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來(lái)，所以使用前應(yīng)用一些帶色的大分子物質(zhì)如細(xì)胞色素C、血紅蛋白或?qū)Ｓ玫乃{(lán)色葡聚糖—2000（Bluedextran-2000）通過(guò)凝膠柱，以檢查形成的帶色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應(yīng)該重新裝柱，直至達(dá)到要求?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五注1：剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來(lái)灌柱，應(yīng)平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠柱會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡影響層析。注2：在整個(gè)灌注凝膠的過(guò)程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進(jìn)入空氣。若進(jìn)空氣，在加入溶液時(shí)，凝膠柱中易形成氣泡。注3：裝好的凝膠柱，使用時(shí)應(yīng)該用相當(dāng)于柱體積兩倍或更多的洗脫液流過(guò)洗脫柱，以壓實(shí)凝膠?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五2、樣品的上柱及洗脫①加樣量的控制分析：1-2ml/100ml床體積，制備：10-30ml/100ml床體積②洗脫液的選擇：首先洗脫液最好與浸泡凝膠時(shí)所用的溶液一致，否則由于更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化而影響分離效果；水溶性物質(zhì)的洗脫用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液，非水溶性物質(zhì)的洗脫用有機(jī)溶劑（苯、丙酮等）。現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五葡聚糖基本上不帶電荷、呈惰性，不與被分離的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羥基，能吸附少量蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，一般使用含有離子強(qiáng)度達(dá)0.08的NaCl等中性鹽作洗脫液?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五凝膠層析加樣操作示意圖現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五圖注：1、平衡好的層析柱。2、沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起。3-4、打開(kāi)下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液，5-7、當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。8-9、最后加入3—4mL洗脫液于凝膠上。10、連接柱層析系統(tǒng)，自動(dòng)收集記錄?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五凝膠分離洗脫與自動(dòng)收集系統(tǒng)現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五實(shí)物圖現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五凝膠層析中的分離行為

藍(lán)葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五3、凝膠的回收與保存凝膠一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮化鈉，在下次層析前將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五三、影響凝膠分離的因素1、流速對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五2、黏度對(duì)分辨率的影響現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五3、凝膠柱層析操作壓操作壓的增加會(huì)影響流速（變快？變慢？），此外還可以導(dǎo)致凝膠膠面下降，柱床容積的改變，相應(yīng)測(cè)出的Vt，Vo，Ve等也改變，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差?，F(xiàn)在是44頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五操作壓與流速的關(guān)系現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五4、加樣量對(duì)分辨率的影響

I.加樣量少時(shí)，A、B二種物質(zhì)完全分開(kāi)。

II.加樣量適當(dāng)時(shí)，A、B二種物質(zhì)剛剛分開(kāi)。III.加樣量太大時(shí)，A、B二種物質(zhì)只能部分分開(kāi)?，F(xiàn)在是46頁(yè)\一共有50頁(yè)\編輯于星期五（1）分析工作時(shí)，樣品體積為柱床體積的1~4%；