免疫熒光實(shí)驗(yàn)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)——iPSC-derive神經(jīng)元的體外神經(jīng)毒性檢測(cè)如今神經(jīng)毒性檢測(cè)主要是依賴活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不僅有倫理問(wèn)題，而且通常非常昂貴并且十分耗時(shí)。當(dāng)需要大規(guī)模的測(cè)試化合物的時(shí)候就不太合適了。因此，高通量的體外的神經(jīng)毒性測(cè)試就顯得十分必要了，而且可以使用人源的細(xì)胞直接進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性也更佳。但是，到目前為止，人源干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元并沒(méi)有適合進(jìn)行這類試驗(yàn)的特質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，批次間差異大，并且有收到倫理和一些法律的制約，使得這種細(xì)胞都不太適用于做大規(guī)模的體外測(cè)試試驗(yàn)。最近，市面上出現(xiàn)了商用的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞，重復(fù)性好，可以用來(lái)做這類的體外神經(jīng)毒性試驗(yàn)。荷蘭的科學(xué)家使用人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞做了免疫熒光染色試驗(yàn)，作為高通量進(jìn)行體外的神經(jīng)細(xì)胞毒性檢測(cè)的預(yù)試驗(yàn)。由不同供應(yīng)商提供的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞混合培養(yǎng)能夠形成不同(激活型或抑制型)神經(jīng)元共培養(yǎng)的樣本。ALTEX.2016Mar24.doi:10.14573/altex.1510091IsthetimerightforinvitroneurotoxicitytestingusinghumaniPSC-derivedneurons?TukkerAM1,deGrootMW1,WijnoltsFM1,KasteelEE1,HondebrinkL2,WesterinkRH1.一、實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：iCell?Neurons(NRC-100-010-001，CellularDynamicsinternational)CDIiCell?Astrocytes(CellularDynamicsinternational)HIPneurons(GSC-4312,MTI-GlobalStem)DOPA.4U?neurons(Axiogenesis,Cologne,Germany)培養(yǎng)基:CompleteiCellNeuronsMaintenanceMedium(with2%iCellNeuronsMediumSupplement)supplementedwithlaminin(10pg/mL)試劑:Poly-L-Ornithine([PLO]0.01%)4)培養(yǎng)耗材:口-Slide8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理(ibidi，Germany，80826)、實(shí)驗(yàn)方法)載玻片包被每孔加入300pl的0.01%的Poly-L-Ornithine溶液室溫孵育60分鐘吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開(kāi)始使用)免疫熒光實(shí)驗(yàn)1）鋪細(xì)胞：iCell?Neurons每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞iCell?Neurons/CDIiCell?Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪66000個(gè)細(xì)胞HIPneurons每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞DOPA.4U?neurons每孔鋪52000個(gè)細(xì)胞DOPA.4U?neurons/iCell?Astrocytes共培養(yǎng)，每孔鋪48000個(gè)細(xì)胞2） 加入約300p1/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘3） 加入300pl1%Triton?X-100的PBS溶液通透3-5分鐘4） 加入300pl2%BSA的PBS溶液封閉20分鐘5） 依次加入一抗，二抗進(jìn)行免疫熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察（圖二）。圖二：圖示鋪細(xì)胞，固定，清洗，染色步驟。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DIV14-|3(|l|)Tubulin/ /DIV8-PDIV14-|3(|l|)Tubulin/ /DIV8-P(MI)Tubulin/ /DJV14-p(lll)Tubwiin/DIVS-vGAl//|?■DOPA.4U-astrocYteco-ciiltureiCellNeuron-astrocyteco-cultureHIPheurons圖三：iPSC-derive神經(jīng)元的免疫熒光染色結(jié)果。不同種類的人源iPSC-derive神經(jīng)元使用0（lll）tubulin（綠色）和GFAP（紅色），用來(lái)區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞（HIP?neurons,左上；DOPA.4U?ne