紫外-可見分光光度法課件

波長nm10-3~-2~1~102.7~104~106.2~108~109頻率Hz1020-19~1017~1014.3~1012.8~1010.7~109~108波數(shù)cm-11010-9~107104.3102.880.10.01波段γ-射線X-射線紫外可見射頻波譜γ-射線光譜X-射線波譜紫外光譜可見光譜順磁共振核磁共振躍遷方式核反應(yīng)內(nèi)層電子躍遷外層電子躍遷分子振動(dòng)分子轉(zhuǎn)動(dòng)，核自旋1第3章紫外－可見分光光度法（ultravioletandvisiblespectrophotometry;UV-vis

）概念：研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)分子吸收光譜的分析方法。（近紫外光區(qū)200-400nm，可見光區(qū)400-760nm）Aλ2分光：將復(fù)合光變成單色光叫分光可見光（400-760nm）紅橙黃綠青藍(lán)紫紅外紫外610-780400-435分光系統(tǒng)3§1基本概念電子躍遷：σ-σ*、п-п*、n-п*、n-σ*（1）躍遷類型σσ*пп*nσ-σ*п-п*n-σ*n-п*成鍵成鍵未成鍵反鍵反鍵能量5（2）吸收強(qiáng)度（ε）：I0與I相差越大，吸收越強(qiáng)?！鱁λI0I同型軌道躍遷幾率大，吸收強(qiáng)；不同型軌道躍遷幾率小，吸收弱。如п-п*吸收強(qiáng)，n-п*吸收弱。當(dāng)ε>104，為強(qiáng)吸收；ε<103為弱吸收；ε=103-104為中吸收6注意：吸收何種光（λ）與能級(jí)差有關(guān)（△E）吸收強(qiáng)度如何（ε）與躍遷機(jī)率有關(guān)。△EλI0I7（3）n-п*躍遷，存在于-C=O，-C≡N，△E更小，λmax

>250nm，ε=10-100。(4)n-σ*躍遷，存在于-OH、-NH2、—X等。λmax

=200nm，末端吸收。9λAA表示物質(zhì)對(duì)不同光的吸收程度300400500600(二)術(shù)語吸收曲線(吸收光譜):

以波長λ（nm）為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)所描繪的曲線。10吸收峰：曲線上吸收最大的地方，它所對(duì)應(yīng)的波長稱最大吸收波長（λmax）。谷：峰與峰之間的部位叫谷，該處的波長稱最小吸收波長（λmin）。末端吸收：在圖譜短波端只呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分稱末端吸收。Aλ吸收峰肩峰（sh）吸收谷末端吸收λmaxλmin11紅移（長移）：使吸收峰向長波方向移動(dòng)。如助色團(tuán)、共軛鍵的影響。藍(lán)（紫）移（短移）：使吸收峰（λ）向短波方向移動(dòng)。如共軛鍵減少或溶劑的影響。增色效應(yīng)和減色效應(yīng)：使吸收強(qiáng)度（ε）增加稱增色效應(yīng)。反之稱減色效應(yīng)或淡色效應(yīng)。強(qiáng)帶和弱帶：化合物的紫外可見吸收光譜中，凡摩爾吸光系數(shù)值（εmax）大于104的吸收峰稱為強(qiáng)帶，凡εmax小于103的吸收峰稱為弱帶。13（三）吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系吸收帶:說明吸收峰在紫外－可見光譜中的位置?？煞譃榱N類型。R帶：由n-п*躍遷引起的吸收帶。如C＝O–NO等特點(diǎn)：（1）λmax>250nm（2）ε<100，為弱吸收（3）溶劑的極性越大，λmax減小200nm250nm14例非極性溶劑極性溶劑Π*nΠ*n15п-п*躍遷，K帶Π*ΠΠΠ*非極性溶劑極性溶劑17п-п*躍遷，K帶n-п*躍遷，R帶，，200nm300nmAλK帶R帶18B帶：苯環(huán)骨架振動(dòng)和環(huán)內(nèi)共軛п-п*重疊所致，是芳香族化合物的特征吸收帶。特點(diǎn):(1)在非極性的溶劑中，B帶230-270nm產(chǎn)生細(xì)微振動(dòng)19E帶：由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個(gè)乙烯的п-п*所產(chǎn)生，分為E1和E2帶。是苯環(huán)的特征吸收譜帶。E1帶：λ＝180nm，ε＝4.7×104。E2帶：λ=200nmε＝7000。21例：B帶λmax

增大，282nmE2帶與K帶合并，移至210-250nmBRK當(dāng)苯環(huán)上有發(fā)色團(tuán)取代并共軛時(shí)，E2帶與K帶合并，吸收帶長移，且使B帶長移。22logε1030020010050040070060080012345遠(yuǎn)紫外區(qū)近紫外區(qū)可見光區(qū)σσ*пП*п*σ＊nn波長(nm)幾種常見的紫外與可見吸收光譜п*nR帶K帶R帶пП*K帶23(四)影響吸收帶的因素1.位阻影響立體空間結(jié)構(gòu)影響共軛效應(yīng)。順式二苯乙烯反式二苯乙烯同分異構(gòu)體：252.跨環(huán)效應(yīng)3.溶劑效應(yīng)：除了影響吸收峰（λ）位置外，還影響吸收強(qiáng)度（ε）和光譜形狀。溶劑極性對(duì)異丙叉丙酮的兩種躍遷吸收峰的影響躍遷類型正已烷氯仿甲醇水遷移п-п*230238237243長移n-п*329315309305短移26二.Lambert-Beer定律Lambert定律：C一定，A＝-logT=K1bBeer定律：b一定，A＝-logT=K2c兩定律合并：A＝a·b·ca=K1K2a為吸收系數(shù)注：吸光度A是指某一波長（λ）下的吸光強(qiáng)度即入射光為單色光29吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)(ε)：在一定條件下，當(dāng)C＝1mol/l，b=1cm時(shí)的吸光度。百分吸收系數(shù)（E1cm1%

）：一定條件下，當(dāng)C＝1％，b=1cm時(shí)的吸光度。30特征：1）ε、E均為特征常數(shù)

2）ε、E是有條件的，同一物質(zhì)，不同條件下所測值不同（波長不同、溶劑不同、溫度不同等）。

3）ε、E越大，測定吸光度靈敏度越高。

4）ε=104-105為強(qiáng)吸收，103-104為中吸收，<103為弱吸收。

5）用于定性判斷，K帶吸收大，ε、E大，R帶的ε、E小。

31例：紫草素（C16H6O5288.3），2.00mg溶于100.0mlEtOH中，b=1cm，λmax=516nm，A=0.484.求ε、E注：若溶液中存在多種吸光物質(zhì)時(shí)，吸光度將是各組分吸光度的總和。A總＝Aa+Ab+Ac+……＝εadCa+εbdCb+εcdCc+……I0a、b、cId注：每種物質(zhì)的吸收度僅由本身的性質(zhì)和C決定，與其它物質(zhì)無關(guān)。32吸光度A具有加和性，對(duì)同一物質(zhì)來說濃度（C）吸光度（A）001CA2C2A3C3A4C4A工作曲線CA負(fù)偏離正偏離線性范圍：線性范圍越大越好。C133三、偏離Beer定律的因素1)化學(xué)因素：離解、締合、配位等化學(xué)變化，使吸光物質(zhì)形態(tài)發(fā)生變化。溶劑、pH、溫度等影響。A＝a·b·c影響吸收系數(shù)a的因素有：1、物質(zhì)的性質(zhì)2、波長的不同3、其它因素如溶劑的影響等34ε×104亞甲藍(lán)陽離子水溶液的吸收光譜abc(a)6.36×10-6mol/l(b)6.36×10-4mol/l(c)6.36×10-3mol/lCA負(fù)偏離610nm660nm352、光學(xué)因素（1）單色光的純度Λ2λ1AλAλBeer定律前題：入射光是單色光。36單色光I0I單色器復(fù)合光狹縫I0比色池760nm400nm可見光II/2譜帶寬度:狹縫具有一定寬度，使分離出的光同時(shí)包含了所需波長的光和附近波長的光。常用半峰寬來表示。單色光的譜帶寬s=λ2-λ112λ510-520透光強(qiáng)度37譜帶寬度的值愈小，單色性愈好。但因仍是復(fù)合光，故仍可以使吸光度變小而偏離Beer定律。38（2）雜散光:與所需波長相隔較遠(yuǎn)的光。IoIsIIs<39（4）非平行光（3）散射、反射克服方法：比色池：擦干凈溶液：溶液均一，透明；用空白作參比?？朔椒ǎ罕壬匚恢梅耪_，與光路垂直。403.透光率測量誤差：△T

（是偶然誤差，來自噪聲）讀數(shù)精度41透光率T%吸光度A△C/C×100%0.022±10.2800.0972.8700.1552.00.0221.630.3991.360.5231.38200.6991.55101.0002.17不同T%或A時(shí)的濃度相對(duì)誤差（△T=

±

0.5%）42結(jié)論：當(dāng)A值在0.2-0.7，相對(duì)誤差較小，是測量最適宜范圍?！鰿/CA0.20.7A=0.434T%=36.8%43§3顯色反應(yīng)及其顯色條件的選擇

一、有色物質(zhì)的測定二、顯色后物質(zhì)的測定441、顯色劑與顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)：在光度分析中將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)。顯色劑：與被測組分反應(yīng)生成有色化合物的試劑，稱為顯色劑。二、顯色后物質(zhì)的測定451、靈敏度高從ε來判斷2、選擇性好3、穩(wěn)定性好顯色反應(yīng)生成有色化合物組成穩(wěn)定。4、顯色劑在測定波長處無明顯吸收一般要求兩者最大吸收波長相差60nm5、反應(yīng)具化學(xué)計(jì)量關(guān)系顯色反應(yīng)的選擇原則461）顯色劑的選擇：生成物穩(wěn)定，且有一定的計(jì)量關(guān)系。2）溶劑：根據(jù)反應(yīng)物、生成物的溶解度確定。2、顯色條件的選擇473）顯色劑的用量：應(yīng)加入略過量的顯色劑。ababAACC484）酸度溶液酸度的影響是多方面的。（1）對(duì)顯色劑顏色的影響（2）對(duì)顯色反應(yīng)影響5）顯色時(shí)間：abAt注：確定實(shí)驗(yàn)方法要考察穩(wěn)定性。6）顯色溫度：顯色反應(yīng)進(jìn)行與溫度有關(guān)。493、反應(yīng)條件的控制確定反應(yīng)條件，需通過實(shí)驗(yàn)考察，已確定的實(shí)驗(yàn)條件，不應(yīng)隨意更改條件。50§4測量條件的選擇1、測定波長的選擇：選擇原則“吸收最大，干擾最小”。如出現(xiàn)幾個(gè)最大吸收波長時(shí)，選擇干擾最小，吸光度較大而且平坦的最大吸收波長。2、控制吸光度測量范圍吸光度控制在0.2-0.7。方法：調(diào)節(jié)溶液的濃度改變吸收池的厚度513、選擇適宜的空白（參比）溶液種類：（1）溶劑空白：溶劑作為空白。適用：溶液中只有被測組分對(duì)光有吸收，其它組分對(duì)光無吸收。（2）試劑空白：與樣品相同條件下，不加試樣溶液，其余均加。適用：測定條件下，顯色劑或其它試劑、溶劑對(duì)待測組分測定有干擾的情況。52（3）試樣空白：如為顯色反應(yīng)，只是不加顯色劑所制備的溶液。適用：試樣基體有色并在測定條件下有吸收。53藥物中微量鐵的測定在2只25ml容量瓶中,用吸量管分別加入0.00,1.00ml鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入1ml鹽酸羥胺,2ml鄰二氮菲,5ml醋酸-醋酸鈉緩沖液,用水稀釋至刻度后搖勻,主置10min.用1cm比色皿,以試劑為空白,在所選波長下,測量吸光度。54單色光I0I單色器復(fù)合光狹縫I0比色池檢測器記錄§5紫外-可見分光光度計(jì)55一、組成：光源－單色器－吸收池－檢測器－記錄鎢燈、氘燈狹縫、色散元件、準(zhǔn)直鏡比色池、比色皿光電池、光電管、光電二極管陣列指針顯示、數(shù)字顯示56光源要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定具有連續(xù)光譜鎢燈和鎢鹵燈：發(fā)射光能的波長覆蓋寬，但紫外區(qū)很弱。常取波長大于350nm的光為可見區(qū)光源。壽命達(dá)10000小時(shí)。氫燈和氘燈：發(fā)射波長為150-400nm的連續(xù)光譜。使用時(shí)間1000小時(shí)。57單色器將光源的連續(xù)光譜變成單色光。組成：進(jìn)口狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、出口狹縫進(jìn)口狹縫出口狹縫色散元件準(zhǔn)直鏡混合光單色光581）色散元件：棱鏡和光柵棱鏡:對(duì)不同波長的光有不同的折射率。缺點(diǎn)：色散后光譜按波長排列疏密不均，長波區(qū)密，短波區(qū)疏。為非均勻分布光譜。分光系統(tǒng)紅紫59光柵:利用光的干涉作用。光特點(diǎn)：色散后的光譜，各譜線間距離相等，是均勻分布的連續(xù)光譜。602）準(zhǔn)直鏡：以狹縫為焦點(diǎn)的聚光鏡。將發(fā)散光變?yōu)槠叫泄?，將色散后的平行光聚焦?13）狹縫：狹縫寬度直接影響分光質(zhì)量。過寬，單色光不純，太窄，光通量小，降低靈敏度。62吸收池（比色池、比色皿）2）用玻璃制成的吸收池，只能用于可見光區(qū)。3）用石英制成的吸收池，可用于紫外光區(qū)。1）型號(hào)有：0.5、1.0、2.0、5.0cm634）吸收池兩光面易損蝕，應(yīng)注意保護(hù)，裝溶液時(shí)，要擦凈。若被污染，要洗凈。使用前進(jìn)行檢查：透光率檢查：以空氣為參比空氣T%=100%，比色皿應(yīng)T%>84%645）使用時(shí)：應(yīng)選擇透光率誤差小于0.5%比色皿配對(duì)使用。配對(duì)性檢查：溶液于440nm處測定透光率。6）應(yīng)注意比色池在光路中的位置要正確。65檢測器將光能轉(zhuǎn)變成電能的裝置。光電池：是一種光敏半導(dǎo)體。要求：靈敏度高，噪聲低分類：硒光電池和硅光電池。特點(diǎn)：光電流大小與照射光強(qiáng)成正比。光電流不易放大，光強(qiáng)弱時(shí)，不能測量。易“疲勞”，不能長時(shí)間使用。A66光電管光陽極光敏陰極放大器指示器特點(diǎn)：電流可放大，較有高靈敏度。有“疲勞現(xiàn)象”67光電倍增管光檔板倍增極（共9個(gè)）陽極光電倍增管大大提高了儀器測量的靈敏度。68光二極管陣列檢測器：由一系列的二極管緊密排列在一塊硅晶體片上組成。光例：HP8452A型二極管陣列：波長范圍為190-820nm，二極管316個(gè)。λA特點(diǎn)：測量速度快69信號(hào)顯示系統(tǒng)（記錄系統(tǒng)）分類：指針顯示數(shù)字顯示T%0100%50%0A721型分光光度計(jì)顯示系統(tǒng)T%100%50%0A721型分光光度計(jì)顯示系統(tǒng)70三、幾種光路的儀器1、單光束（傳統(tǒng)）特點(diǎn)：儀器結(jié)構(gòu)簡單，靈敏度高，但對(duì)光源發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定性要求高。712、雙光束：普遍被采用。特點(diǎn)：可減免因光源強(qiáng)度不穩(wěn)而引入的誤差，但靈敏度較單光束差。723、二極管陣列特點(diǎn)：全波長測定，測定速度快。73§5

分析方法一、定性方法光譜特征：光譜形狀、吸收峰數(shù)目、吸收峰波長位置（峰形、峰數(shù)、峰位）定性依據(jù)：1、結(jié)構(gòu)相同的化合物在相同條件下有完全相同的吸收光譜。2、吸收光譜不同，一定不是相同物質(zhì)。3、吸收光譜相同，可能是相同物質(zhì)。741.比較吸收光譜將試樣與標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖或文獻(xiàn)所載的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行核對(duì)。定性鑒別方法：75醋酸氫化可的松醋酸可的松醋酸潑尼松局限性：不同種化合物可以有雷同的吸收光譜，因此得到相同的吸收光譜，應(yīng)考慮并非同一物質(zhì)的可能。76對(duì)比法1、比較吸收光譜特征數(shù)據(jù)λmax、εmax一致性安宮黃體酮決諾酮772、比較吸光度（吸光系數(shù)）的比值不只一個(gè)吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處測得吸光度比值作為鑒別的依據(jù)?？上^對(duì)誤差(或濃度、吸收池厚度)。例：中國藥典規(guī)定：B12在361nm、278nm吸光度的比值應(yīng)為1.70-1.88;361nm、550nm比值為3.15-3.45。78作用：推斷發(fā)色團(tuán)及其之間的共軛關(guān)系，推斷分子的骨架。１、飽和碳?xì)浠衔镞@類化合物在200-400nm沒有吸收，在紫外吸收光譜分析中常用作溶劑。二、結(jié)構(gòu)分析793、含有K帶吸收，有共軛雙鍵。2、在200nm左右有吸收，可能有孤立雙鍵。4、含有R帶吸收，有C＝O等鍵5、含有B帶，有苯環(huán)80三、純度檢測：1、雜質(zhì)檢查A化合物無吸收雜質(zhì)強(qiáng)吸收則含少量雜質(zhì)可用光譜檢查出來81B化合物強(qiáng)吸收雜質(zhì)無吸收雜質(zhì)存在使化合物的表觀吸收系數(shù)值降低C化合物強(qiáng)吸收雜質(zhì)更強(qiáng)吸收雜質(zhì)存在使化合物的表觀吸收系數(shù)值升高822、雜質(zhì)限量檢測：腎上腺素中含雜質(zhì)腎上腺酮在310nm處，A<0.05310nm腎上腺酮腎上腺素83§5定量分析方法測定條件：①波長的選擇②控制A大?、圻x擇合適的溶劑84選擇合適的溶劑選擇原則：a安全、無毒b被測物的溶解度大C不干擾：許多溶劑本身在紫外光區(qū)有吸收峰，所選用的溶劑應(yīng)不干擾被測組分的測定。截止波長：10mm光徑長度透過率<25%（A=0.6020）的波長。組分的測定波長必須大于溶劑的截止波長。85溶劑極性截止波長（nm）危險(xiǎn)性蒸餾水78.5<200無正已烷1.9199易燃無水乙醇24.3215易燃甲醇32.6215易燃/有毒環(huán)已烷2.0211易燃/有毒氯仿4.8245易燃/有毒二甲亞砜無270有毒丙酮20.7331易燃一些常用溶劑性質(zhì)86注：使用易揮發(fā)性溶劑，最好用帶蓋的樣品池，以防溶劑揮發(fā)，改變樣品濃度。綜上所述：常用溶劑中水、異丙醇、