臨床基因組學(xué)檢驗課件副本-第4章 熒光原位雜交技術(shù)-1

第4章

熒光原位雜交技術(shù)胡昌明2017年4月14日原位PCRChromosome9Chromosome22ABLBCRABLBCRt(9;22)Philadelphia(Ph)chromosome922Ph+CytogeneticsBCR-ABL(Tyrosinekinase)SignalingpathwaysRasAKTPI3KOtherpathwaysDeregulationCellproliferationCellsurvivalDNArepairCMLWBC(myeloid)RBCPlatelets+Tyrosinekinaseinhibitors(TKIs)->>以BCR/ABL為例正常信號模式為：2G2R（如左圖）典型陽性信號模式為：1G1R2F（如右圖）標(biāo)記位點：紅:ABL(9q34)

綠:BCR(22q11)G代表綠色信號，R代表紅色信號，F(xiàn)代表融合信號。原位PCRCONTENTS目錄FISH檢測的基本原理FISH檢測的流程FISH檢測的臨床應(yīng)用概念

原位雜交(insituhybridization,ISH)是應(yīng)用生物化學(xué)中核酸分子雜交的原理,在組織切片、細胞涂片或印片上原位檢測某種DNA或RNA序列的一項技術(shù)。1969年美國耶魯大學(xué)Gall等首先通過基因探針將核糖體基因在爪蟾卵母細胞上進行定位。FISH是一種“釣魚”技術(shù)；通過熒光標(biāo)記的探針與細胞核內(nèi)的靶序列雜交獲得細胞內(nèi)多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息始于20世紀80年代相當(dāng)于免疫學(xué)中抗原－抗體的反應(yīng)按雜交對象：組織細胞染色體按探針標(biāo)記物同位素（放射性）標(biāo)記探針非同位素標(biāo)記探針熒光標(biāo)記：最常用的為生物素、地高辛(Digxigenin,DIG)、羅丹明（Rhodamine）、熒光素（Fluorescence）、PI、DAPI酶標(biāo)：如辣根過氧化酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)等。按細胞周期來分間期FISH中期FISH是含有互補順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測細胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上。用于原位雜交的探針有不同種類，可用于不同靶核酸的探測。FISH探針定義

1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

1）免疫酶聯(lián)

2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位雜交的不足之處：

1）不穩(wěn)定；

2）高背景；

3）曝光時間長；

4）結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理繁瑣。5）同位素的使用和處理

熒光原位雜交（FISH）的原理以BCR/ABL為例正常信號模式為：2G2R（如左圖）典型陽性信號模式為：1G1R2F（如右圖）標(biāo)記位點：紅:ABL(9q34)

綠:BCR(22q11)G代表綠色信號，R代表紅色信號，F(xiàn)代表融合信號?；蚱螖U增1基因片段缺失2基因片段倒位、易位等31、安全、可靠；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度接近放射性探針；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。優(yōu)點

FISH探針類型

重復(fù)DNA序列單拷貝或低拷貝的DNA序列基因組DNA重復(fù)DNA序列探針重復(fù)DNA序列、多基因家族作為探針與染色體原位雜交。容易產(chǎn)生較高的分辨率。因為這些DNA多拷則序列在染色體上可達幾十個kb或幾個Mb。日前所使用的這類探針有45SrDNA,5SrDNA、著絲點序列、端粒序列、亞端粒序列、轉(zhuǎn)座子等。單拷貝或低拷貝DNA探針這類探針包括某個基因的DNA克隆等。這些探針DNA序列一般只有1-2kb.因而這類標(biāo)記的原位雜交存在幾個方面的困難:1)需要用多層抗體結(jié)合來放大雜交信號2)雜交信號很弱時.難以與背景信號區(qū)分3)能夠顯示雜交信號的細胞比例很低基因組DNA探針利用不同基因組DNA同源性程度的差異。在原位雜交中只標(biāo)記某一基因組或某個物種的基因組DNA。在雜交中標(biāo)記的基因組DNA首先與其完全同源的DNA雜交。可以檢測出導(dǎo)入異源多倍體的外源染色體或染色體片段，同時可以清楚地顯示出易位與交換的位置。1．重復(fù)序列探針(1)著絲粒探針此類探針的雜交靶常大于1Mb，探針與靶DNA結(jié)合緊密，雜交信號強，易于檢測。主要用于檢測染色體的數(shù)目，鑒定單體、三體、多體、多倍體以及標(biāo)志染色體等染色體異常。按染色體上位置分類探針(2)異染色質(zhì)探針人類1，6，9，16號染色體著絲粒附近及Y染色體長臂含有明顯的異染色質(zhì)區(qū)，異染色質(zhì)探針除了可代替著絲粒探針用于檢測染色體數(shù)目異常外，還可用于分析涉及這些異染色質(zhì)區(qū)的染色體結(jié)構(gòu)改變。(3)端粒探針人體染色體長、短臂末端均有簡單重復(fù)序列組成的端粒結(jié)構(gòu)，端粒探針主要用于確定染色體數(shù)目、末端缺失和染色體易位等。2．涂染探針染色體涂染探針的雜交靶或為整條染色體，或為染色體的單臂，也可以是染色體的特定區(qū)帶。這類探針在鑒定標(biāo)志染色體的來源、染色體易位等方面效果較好。其最重要的應(yīng)用是對常規(guī)細胞遺傳學(xué)顯帶方法難以鑒定的畸變?nèi)旧w進行分析。不過，染色體涂染探針常不能顯示著絲粒及端粒區(qū)域。(1)整條染色體涂染探針主要用于染色體易位、重排的檢測及鑒定標(biāo)志染色體的來源，但其不能分辨同一染色體臂間易位及染色體倒位。(2)染色體單臂涂染探針用于染色體易位（包括臂間易位）、重排的檢測及判斷標(biāo)志染色體的來源。(3)染色體區(qū)帶涂染探針可用于檢測染色體區(qū)帶的擴增、缺失、倒位以及染色體間、染色體內(nèi)的易位。3．基因探針及其它單基因探針是針對基因組上的單一核苷酸序列。（1）種類：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）應(yīng)用

（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗證；

（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；

（c）染色體斷裂點分析。

（d）間期細胞染色體數(shù)目異常診斷。

centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaint探針的分類CEP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點特異性探針WCP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針根據(jù)化學(xué)組成，可以將探針分為:DNA探針RNA探針PNA：肽核苷酸（PNA）探針CONTENTS目錄FISH檢測的基本原理FISH檢測的流程FISH檢測的臨床應(yīng)用間期FISH中期FISHCONTENTS目錄FISH檢測的基本原理FISH檢測的流程FISH檢測的臨床應(yīng)用以BCR/ABL為例正常信號模式為：2G2R（如左圖）典型陽性信號模式為：1G1R2F（如右圖）標(biāo)記位點：紅:ABL(9q34)

綠:BCR(22q11)G代表綠色信號，R代表紅色信號，F(xiàn)代表融合信號。1、腫瘤個體化治療中的應(yīng)用（以CML為例）2、遺傳病診斷過程的應(yīng)用重復(fù)序列或多拷貝的基因家族的