糖代謝的中心途徑分析

糖代謝的中心途徑Thecenterpathwaysofthecarbohydratemetabolism東南大學醫(yī)學院生物工程學系徐旭東

x_xdong@126.com代謝(metabolism)：細胞內發(fā)生的各種化學反應的總稱。代謝包括物質代謝和能量代謝，前者分分解代謝和合成代謝；后者分產能代謝和耗能代謝。分解代謝合成代謝第一節(jié)微生物代謝概論物質代謝能量代謝產能代謝耗能代謝初級代謝次級代謝代謝一、物質代謝物質代謝分解代謝（catabolism）合成代謝（anabolism）復雜分子（有機物）分解代謝合成代謝簡單小分子ATP[H]細胞中蛋白質、核酸、糖、脂等物質的變化過程稱為物質代謝。可分為分解代謝和合成代謝。++分解代謝和合成代謝的關系分解代謝往往伴隨能量的產生；合成代謝往往伴隨能量的消耗。糖的分解代謝脂肪碳水化合物蛋白質二、能量代謝微生物細胞中能量的產生、消耗、轉移的過程稱為能量代謝。用于生物合成用于運動、物質轉運等三、初級代謝和次級代謝初級代謝(primarymetabolism)：微生物通過代謝合成細胞生長和繁殖所必需的化合物的的過程。初級代謝的產物稱初級代謝產物，如氨基酸、核苷酸、維生素等。次級代謝(secondarymetabolism)：微生物通過代謝合成對細胞生長和繁殖作用不明顯、或沒有作用的化合物的的過程。次級代謝的產物稱次級代謝產物，如抗生素、生物堿、毒素、色素等。四、代謝和酶1.酶是由生物細胞所產生的、具有催化性質的蛋白質；2.微生物的生命活動離不開酶；3.酶的活動受微生物調控機制制約；4.了解微生物代謝及調控機制是利用微生物的基礎。微生物的分解代謝分為三個階段：①將蛋白質、多糖以及脂類等大分子物質降解為氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(往往在細胞外進行)；②將上述小分子進一步降解為丙酮酸、乙酰輔酶A等小分子中間體（細胞內進行）；③將這些小分子中間體分解為二氧化碳。第②、第③階段伴隨著ATP、NAD(P)H+及FADH2的產生。分解代謝產生的NAD(P)H+及FADH2的H和電子通過電子傳遞鏈被氧化，產生ATP。

蛋白質多糖脂類氨基酸單糖甘油＋脂肪酸丙酮酸糖酵解CoA檸檬酸α酮戊二酸草酰乙酸階段1階段2階段3CoQ細胞色素ATPNADH2+FADH2ATP+NADH2NADH2乙酰三羧酸循環(huán)ATPNADH2FADH2O2CO2NADH2第二節(jié)微生物的分解代謝及能量產生CO2一、萄萄糖分解途徑（一）EMP途徑(Embden-Meyerhofpathway)Embden-Meyerhof-pathway很多微生物采用基團轉位的方式得到6-磷酸葡萄糖藕聯(lián)基團轉位Enol：烯醇EMP途徑的總反應式：Glucose+2NAD++2ADP+2Pi

→

2pyruvate+2NADH·H++2ATP+2H2OEMP途徑的生理意義：1.提供合成代謝必需的ATP和還原力NADH·H+；2.連接其它代謝途徑的橋梁：TCA，HMP，ED等；3.通過一些代謝中間產物；4.逆向反應進行糖異生；5.與乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇發(fā)酵有關。EMP途徑的關鍵酶：磷酸果糖激酶PFK、丙酮酸激酶PK（一）EMP途徑（Embden-Meyerhofpathway）（二）HMP途徑(HexoseMonophosphatePathway)HMP途徑即己糖單磷酸途徑，其過程包括兩個階段：一是氧化階段：6-磷酸-葡萄糖氧化成5-磷酸-核酮糖；二是分子重排階段：五碳糖重排成為三碳糖和六碳糖。降解發(fā)生在6-磷酸-葡萄糖酸，所以命名為己糖單磷酸途徑(HMP)。5-磷酸-戊糖水平發(fā)生分子重排，所以又可以命名為磷酸戊糖途徑(pentosephosphatepathway,PPP)很多微生物可以不通過TCA循環(huán)將葡萄糖徹底降解為CO2。1.HMP途徑的關鍵酶：6磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phospoatedehydrogenase）6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phospogluconatedehydrogenase）2.HMP途徑的特征酶：轉酮酶（transketolase,TK）轉醛酶（transaldolase,TA）小分子前體5-磷酸-核酮糖、核糖、木糖4-磷酸-赤蘚糖3-磷酸-甘油醛7-磷酸-景天庚酮糖還原力NADPH2

HMP途徑可以為微生物生長提供能量、小分子前體和還原力。也擴大了碳源利用的范圍乳酸桿菌(Lactobacterium)中無HMP，在其培養(yǎng)過程中，必須添加嘌呤、嘧啶等物質。3.HMP途徑的生理意義：用于核苷酸、核酸及NAD(P)＋、FAD、FMN、CoA等合成用于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸等芳香族氨基酸的合成連接脂肪酸代謝途徑，用于甘油、脂肪的合成HMP途徑的總反應式不完全的HMP：完全的HMP：Glucose-6-phosphate+6NADP+

3CO2+6NADPH2+GAPGlucose-6-phosphate+12NADP+

6CO2+12NADPH2+Pi（三）ED途徑(Entner-DoudoroffPathway)ED途徑由Entner和Doudoroff(Russia)2人研究嗜糖假單孢菌(Pseudomonassaccharophila)中發(fā)現(xiàn)，故名。另外在下列細菌中也存在ED途徑：Pseudomonasaeruginosa、Pseudomonasfluorescens、Pseudomonaslindneri、Zymomonasmobilis；ED途徑的降解在2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸(2-keto-3-deoxy-6-phosphoglucnicacid,KDPG)上發(fā)生。

ED途徑是細菌進行乙醇、乳酸發(fā)酵的重要方式。philharmonicMichaelDoudoroff

(1911-1975)wasanAmerican

microbiologist

whodiscoveredwith

NathanEntnermicrobialpathwayforglucosedegradationinsomebacteria.Nowadaysitisknownas

Entner-Doudoroofpathway.HewasborninSt.Petersburg,Russiabutmovedto

SanFrancisco

whenhewas12yearsold.Heentered

StanfordUniversity

(1929)wherehecompletedhisPhDunderthesupervisionof

CorneliusVanNielatthe

HopkinsMarineStation.GlucoseGlucose-6-phosphate6-phosphogluconicacid2-keto-3-deoxy-6-phosphoglucnicacidPyruvateGAPPyruvateATPADPNAD＋NADH2H2OKDPGaldolaseED途徑glucotate-6-phosphatedehydrataseglucose-6-phospoatedehydrogenase類似EMP2ATPNADH2類似HMP特征性反應1.ED途徑的關鍵酶：6磷酸葡萄糖酸脫水酶（glucose-6-phosphatedehydratase）KDPG醛縮酶（特征酶）（2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconicacidaldolase）2.ED途徑的總反應式：Glucose+NAD++NADP++ADP+2Pi2pyruvate+NADH2+NADPH2+ATP來源不同！3.如何區(qū)別ED途徑和EMP途徑？CHOCCCCCH2OPiOHHOOHOHHHHHCOOHCCCCCH2OPi=OHOHOHHHHGlucoseKDPGCCH3=OCCH3=OED途徑呼吸的CO2來自C1和C4，EMP途徑呼吸的CO2來自C3和C4pyruvateCOOHCOOHEDCCCCCH2OPiOHHOOHOHHHHHCH2OPiCCCCCH2OPi=OHOOHOHHHHGlucoseDPFCH3CCOOH=OCOOHCCH3=OpyruvateCHOEMPED途徑呼吸的CO2來自C1和C4，EMP途徑呼吸的CO2來自C3和C4釀酒酵母產朊假絲酵母產黃青霉大腸桿菌氧化葡萄糖桿菌運動發(fā)酵單孢菌EMPHMPED88%12%066-81%19-34%077%23%072%28%00100%000100%銅綠假單孢菌029％71%三種代謝途徑在微生物中的分布（四）PK途徑（phosphoketolasepathway）即磷酸酮解途徑。根據(jù)降解分子的不同，又可分為磷酸戊糖酮解途徑(phosphopentoseketolasepathway,PPK)和磷酸己糖酮解途徑(phosphohexoseketolasepathway,PHK)即雙歧途徑。PK途徑由Warberg、Dickens、Horeker等發(fā)現(xiàn)，故稱WD途徑。PPK途徑是乳桿菌(Lactobacterium)進行乳酸發(fā)酵的重要方式；PHK途徑實際上包括PPK和PHK，存在于雙歧桿菌(Bifidobacterium)中。glucoseglucose-6-phosphate6-phosphogluconicacidribulose-5-phosphatexylulose-5-phosphateGAPacetyl-CoApyruvatePhosphopentoseketolase(關鍵酶)Glucose+NAD++ADP+Pipyruvate+CO2+Acetyl-CoA

2+3NADH2+

ATPPPK途徑的總反應式ATPADPNAD+NADH2NAD+NADH2阿拉伯糖木糖核糖PPK途徑類似EMP類似HMPCO2NADH22ATP2×Glucose2×glucose-6-phosphateribulose-5-phosphatexylulose-5-phosphate2GAP2acetyl-CoA2PyruvatePhosphopentoseketolase(關鍵酶)xylulose-5-phosphateribose-5-phosphateGAPS7PE4PF6PF6Pacetyl-CoAPhosphohexoseketolase(關鍵酶)PHK途徑2Glucose+2NAD++3ADP+3Pi2pyruvate+3acete+2NADH2+

5ATPPHK途徑的總反應式2NADH24ATP2ATPAcetateATPADP2ADPAcetate＋2ATP（五）直接氧化途徑有些細菌，如Pseudomanas、Aerobacter等沒有己糖激酶（hexokinase），無法進行葡萄糖的磷酸化，但是可以通過加氧酶的直接氧化作用，將葡萄糖降解。某些真菌則通過葡萄糖氧化酶完成類似的過程。加氧酶和葡萄糖氧化酶的輔基均為FAD。GlucoseGluconicacid6-phosphogluconicacidribulose-5-phosphateFADFADH2NAD+NADH2H2O2ATPADPO2H2O+O2catalaseCO2KDPGH2OHMP途徑ED途徑加氧酶Pseudomanas、AerobacterPseudomanas直接氧化途徑NADH?H+或NADPH?H+有氧呼吸：電子或H交給O2。厭氧呼吸：電子或H交給無機物。發(fā)酵：電子或H交給糖降解產物，如丙酮酸。來自EMP、HMP、ED等途徑二、圍繞中心途徑的發(fā)酵(fermentation)巴斯德的“發(fā)酵”定義：酵母菌在厭氧條件下進行的代謝過程。發(fā)酵的“生理學定義”是：將電子或氫交給糖降解產物的過程。

現(xiàn)代“發(fā)酵”的概念，已經(jīng)遠遠超出其生理學定義：凡是利用微生物進行的產品生產過程，均稱之為“發(fā)酵”。根據(jù)產物的不同，可以分為多種形式。圍繞中心途徑的發(fā)酵（一）乙醇和甘油發(fā)酵1.酵母菌的第一型發(fā)酵(乙醇發(fā)酵)條件：pH3.5~4.5，厭氧；關鍵酶：丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶；特點：H的完全平衡?？偡磻剑篏lucose+2ADP+Pi2Eth-OH+2CO2+2H2OAcetobacter、Zymomonasmobilis、Sarcinaventriculi、Erwiniaamylovora也可進行乙醇發(fā)酵，但是以ED途徑進行。CarlNeuberg

2.酵母菌的第二型發(fā)酵(甘油發(fā)酵)條件：pH中性或微酸性，添加3％亞硫酸氫鈉；關鍵酶：α-磷酸-甘油脫氫酶、α-磷酸-甘油酯酶；特點：每個葡萄糖只產生一分子甘油，不產ATP，故亞硫酸氫鈉必須是亞適量，以保證基礎代謝的能量供應?？偡磻剑篏lucose+NaHSO3

Glycerol+CO2+磺化乙醛丙酮酸CO2乙醛NADHNAD+乙醇磷酸二羥基丙酮NADHNAD+磷酸甘油甘油3%的亞硫酸氫鈉（pH7）酵母菌的一型發(fā)酵（磺化羥基乙醛）酵母菌的乙醇和甘油發(fā)酵比較酵母菌的二型發(fā)酵葡萄糖EMP丙酮酸脫羧酶乙醇脫氫酶3.酵母菌的第三型發(fā)酵(甘油發(fā)酵)條件：pH7.5，厭氧；此時乙醛成為不正常的H受體，2分子乙醛之間發(fā)生氧化還原反應(歧化反應)，一個得到H成為乙醇，一個失去H成為乙酸。特點：不產ATP?？偡磻剑?Glucose2Glycerol＋Eth-OH+Acetate+2CO2思考：第三型發(fā)酵時培養(yǎng)基中添加CaCO3的重要作用？2葡萄糖2丙酮酸2乙醛乙醇乙酸EMP丙酮酸脫羧酶2CO2NADH22GAP+2DHAP4ATP4ADP4ATP+2NADH22α-磷酸-甘油2甘油酵母菌的第三型發(fā)酵第一次世界打戰(zhàn)期間德國主要用這種方法生產甘油產量：1000噸/月目前甘油發(fā)酵使用的微生物Dunaliellasalina(一種嗜鹽藻類)胞內積累高濃度的甘油從而使細胞的滲透壓保持平衡生活在鹽湖及海邊的巖池等鹽濃度很高環(huán)境葡萄糖1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羥丙酮α-磷酸甘油甘油丙酮酸乙醛乙醇＋乙酸乙醇磺化羥基乙醛NADH2CO2②①③②③總結：酵母菌的發(fā)酵過程（二）乳酸發(fā)酵1.同型乳酸發(fā)酵關鍵酶：乳酸脫氫酶；特點：H的完全平衡；不產CO2?？偡磻剑篏lucose+2ADP+2Pi2Lactate+2ATP制作酸奶、泡菜、青貯飼料，都是乳酸發(fā)酵的過程。2.異型乳酸發(fā)酵腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroids)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostocdextranicum)等以PPK的方式進行乳酸發(fā)酵。產物包括乳酸和乙酸。3.雙歧途徑兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)等以PHK的方式進行乳酸發(fā)酵。產物包括乳酸和乙酸。梭菌(Clostridium)、丁酸弧菌(Butyriolbrio)、梭桿菌(Fusobacterium)利用最常見。丙酮酸首先在鐵氧還蛋白還原酶作用下轉變?yōu)橐阴oA，再逐步形成丁酸。（三）丁酸發(fā)酵和丙酮-丁醇發(fā)酵1.丁酸發(fā)酵總反應式：Glucose＋3ADPButyrate＋2CO2＋2H2＋3ATPCH3－C－COOHGlucoseEMPOCH3－C～CoAO2XCO2FdFdH2CoA2×2×CH3－C－CH2－C～CoAOOCH3－CH－CH2－C～CoAOHOαβCH3－CH＝CH－C～CoAOCH3－CH2－CH2－C～CoAOCH3－CH2－CH2－C－OHONADH2NAD+H2ONADH2NAD+乙酸乙酰CoA2ATP+2NADH2Pyr-Fd氧化還原酶乙酰CoA乙酰轉移酶β羥丁酰CoA脫氫酶羥丁酰脫水酶丁酰CoA脫氫酶CoA轉移酶丁酸發(fā)酵ATPADP英國：ChaimWeizmann闡明機理并實現(xiàn)發(fā)酵生產。2.丙酮-丁醇發(fā)酵總反應式：2Glucose＋5ADPButanol＋Acetone＋5CO2＋4H2丙酮丁酸梭菌(Clostridiumacetobutylicum)進行發(fā)酵時，先合成丁酸，當pH降至4.5時，產生丙酮和丁醇。估計與CoA轉移酶活化有關。CH3－C－COOHO4×CH3－CH2－CH2－C～CoAOCH3－CH2－CH2－CHOCH3－CH2－CH2－CH2OHNADH2NAD+CoA丁醛脫氫酶丁醇脫氫酶NADH2NAD+CH3－C－CH2－C～CoAOOCH3－C－CH2－COOHOCH3－C－CH3OCoA轉移酶脫羧酶CO2乙酸乙酰CoA丙酮-丁醇發(fā)酵發(fā)酵4×GlucoseEMP類似丁酸發(fā)酵丙酮：用于生產人造橡膠丁醇：用于生產無煙火藥英國在第一次世界大戰(zhàn)期間，有機溶劑丙酮和丁醇的需求增加。當時的常規(guī)生產方法：對木材進行干熱分解，大約80到100噸樺樹、山毛櫸、或楓木生產1噸丙酮。1915年Weizmann發(fā)明發(fā)酵法生產丙酮-丁醇：每100噸谷物可以生產出12噸丙酮和24噸的丁醇。魏茨曼是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵之父ChaimWeizmann(1874-1952)andEinstein/wiki/Chaim_Weizmann

Earlylifeandcareer

WeizmannwasborninthesmallvillageofMotol(Motyli,nowMotal')nearPinskintheRussianEmpire(todayinBelarus).HegraduatedtheUniversityofFribourginSwitzerlandin1899withadegreeinchemistry.HelecturedinchemistryattheUniversityofGenevabetween1901and1903)andlatertaughtattheUniversityofManchester.HebecameaBritishsubjectin1910,andinWorldWarIhewasdirectoroftheBritishAdmiraltylaboratoriesfrom1916until1919.WhilealectureratManchesterhebecamefamousfordiscoveringhowtousebacterialfermentationtoproducelargequantitiesofdesiredsubstances.

Heisconsideredtobethefatherofindustrialfermentation.

HeusedthebacteriumClostridiumacetobutylicum(theWeizmannorganism)toproduceacetone.AcetonewasusedinthemanufactureofcorditeexplosivepropellantscriticaltotheAlliedwareffort(seeRoyalNavyCorditeFactory,HoltonHeath).WeizmanntransferredtherightstothemanufactureofacetonetotheCommercialSolventsCorporationinexchangeforroyalties.（四）混和酸發(fā)酵和丁二醇發(fā)酵1.混和酸發(fā)酵埃希氏菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)及沙門氏菌屬(Salmonella)有2個作用于pyr的多酶復合體：Pyr脫氫酶復合體Pyr-甲酸裂解酶(厭氧條件時誘導合成，有氧時失活)。GlucosePEPPyrAce~CoAHCOOHCO2H2Ace~PiAcetateOAASuccLactatePyr－甲酸裂解酶甲酸-H2裂解酶大腸埃希氏菌：產酸產氣志賀氏菌及沙門氏菌：產酸不產氣Methylredtest：產酸，加甲基紅，變紅色混和酸發(fā)酵2.丁二醇發(fā)酵腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)及歐文氏菌屬(Erwinia)具有作用于pyr的第三個酶：α-乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,AS

)。該途徑中間產物3-羥基丁酮在堿性條件下，形成二乙酰，二乙酰和胍基化合物形成紅色的反應。此即VP反應(Voges-Proskauertest)的原理。丁二醇發(fā)酵GlucosePyrα-乙酰乳酸HCOOHCO2H2Lactateα-乙酰乳酸合成酶甲酸-H2裂解酶Voges-Proskauertest：Enterobacter：紅色Escherichia：不變色Ace~CoA3-羥基丁酮2,3-丁二醇CO2CO2NAD+NADH2二乙酰紅色化合物OH－Pyr－甲酸裂解酶含胍基的化合物TCA（五）丙酸發(fā)酵丙酸細菌（Propionibacterium）可以進行該過程。1、succ-prop途徑GlucosePyrEMPOAAMalFumNADH2NAD＋H2OSuccNADH2NAD＋Succ～CoA甲基丙二?！獵oA丙?！獵oACO2-BioBiotin丙酸甲基丙二?！獵oA異構酶(VB12為輔基)2、Propenoicacid途徑GlucosePyrEMPD-lactateL-lactate2H2羥-丙酰CoA丙烯?！獵oA丙酰～CoA丙酸CoAH2O機制不明三、呼吸作用(respiration)NADH?H+或NADPH?H+有氧呼吸：電子或H交給O2。厭氧呼吸：電子或H交給無機物。發(fā)酵：電子或H交給糖降解產物，如丙酮酸。來自EMP、HMP、ED等途徑（一）有氧呼吸(Aerobicrespiration)糖酵解(glycolysis)三羧酸循環(huán)(citricacidcycle)氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)分三步走——IRREVERSIBLEbypyruvatedehydrogenasecomplex=3enzymes：E1:pyruvatedehydrogenase,thiaminepyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyltransacetylase,lipoicacid,coenzymeA-SHE3:dihydrolipoyldehydrogenase,NAD+,FAD1.三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle,TCA)（1）丙酮酸氧化成乙酰輔酶A及CO2Swingingarmfunctionoflipoicacid所有丙酮酸氧化脫羧的中間產物均緊密地結合在復合體上，活性中間產物可以通過轉乙酰基酶上賴氨酸和硫辛酸形成的擺動長臂(Swingingarm)從酶的一個活性位置轉移到另一個活性位置。E.colipyruvatedehydrogenasecomplex丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉移酶(E2)和二氫硫辛酸脫氫酶(E3)，6種輔因子(TTP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA和Mg2+)4C1.Condensation6C2C2.Oxidative

decarboxylationto5C5C3.Oxidativedecarboxylationto4C4C5.RegenerationofoxaloacetatefromsuccinateTricarboxylicacid(TCA)cycle4.Substrate-levelphosphorylation（2）TCA循環(huán)citratesynthaseaconitaseisocitratedehydrogenaseCitricacidcyclea-ketoglutaratedehydrogenasesuccinylCoAsynthasesuccinatedehydrogenasefumarasemalatedehydrogenaseGlucose2Pyruvate

2AcetylCoA2NADH2NADH2NADH2“ATP”2FADH22NADHNetreactionof1turnofthecitricacidcycleAcetylCoA+3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+FADH2+ATP+2H++CoA思考：1.細菌將1分子葡萄糖完全降解為CO2產生多少ATP?2.真核微生物(酵母菌)和原核微生物(細菌)相比較，將1分子葡萄糖完全降解為CO2產生的ATP數(shù)量上少2個，為什么？TCA循環(huán)的作用a.提供大量能量；b.提供大量小分子前體；c.是糖、蛋白、脂代謝的樞紐。TCA循環(huán)的關鍵酶a.檸檬酸合成酶(citratesynthetase,CS)b.異檸檬酸脫氫酶(isocitratedehydrogenase,ID)c.α-酮戊二酸脫氫酶(a-ketoglutaratedehydrogenase,a-KGD)AcetylCoAoxaloacetatea-ketoglutarateFattyacidAminoacid（3）回補途徑(anapleroticpathway)回補途徑是微生物為補充代謝過程中消耗的中間產物而采取的一些將CO2、乙酸等物質轉化為消耗的中間產物，尤其是TCA循環(huán)中間物的過程。①C1回補方式a.PEP羧化酶(PEPcarboxylase)COOHCO~pCH2+CO2+H2OPEPcarboxylaseCOOHC=OCH2COOHb.丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase)COOHC=OCH3+CO2pyruvatecarboxylaseCOOHC=OCH2COOHc.蘋果酸酶(malatesynthetase)COOHC=OCH3+CO2COOHCHOHCH2COOH+ATP+H2ONADPH2+malatesynthetase②C2回補方式——乙醛酸循環(huán)很多微生物可以以乙酸、乙醇等作為唯一碳源和能源，合成草酰乙酸，完成這個過程的反應即乙醛酸循環(huán)(glyoxylatecycle)。乙醛酸循環(huán)需要3個關鍵酶：a.異檸檬酸裂解酶(Isocitratelyase)b.蘋果酸合成酶(malatesynthetase)c.乙酰輔酶A合成酶(AcetylCoAsynthetase)乙醛酸循環(huán)總反應式：2acetate→

Malate③回補途徑與蘋果酸合成理論產率=134/180=74.5%理論產率=3*134/2*180=111.6%馬來酸即順丁烯二酸富馬酸即反丁烯二酸蘋果酸，又名2-羥基丁二酸蘋果酸是人體內部循環(huán)的重要中間產物，易被人體吸收，因此作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)療和保健品等領域。蘋果酸主要生產國有美國、加拿大、日本等，產量每年約4萬噸，2013年世界總需求約為10萬噸，市場潛在需求量達到每年6萬噸，可見市場發(fā)展空間之大。（4）TCA相關的發(fā)酵——檸檬酸發(fā)酵檸檬酸(Citric

acid)分子式為C6H807。外觀為白色顆粒狀或白色結晶粉末，是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸。無色晶體，常含一分子結晶水，無臭，有很強的酸味，易溶于水。檸檬酸廣泛存在于各種水果和蔬菜中，在動物的骨骼、血液、肌肉中也有分布。檸檬酸在工業(yè)，食品，化妝等行業(yè)具有廣泛的用途。TCA相關的發(fā)酵包括Asp族和Glu族氨基酸發(fā)酵，合并在后面講。NADH脫氫酶FMNCoQcytbcytccytaa3cytc1NADH2ATPATPATP真核微生物的電子傳遞鏈FADH22.氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)化學滲透學說(Chemiosmosis)原核微生物電子傳遞鏈的特點：電子供體多樣化。除大多數(shù)有機物外，一些無機元素如H、S、Fe2＋、NH4＋均可作為電子供體；細胞色素多樣化。不同細菌中計有a、a1、a2、b、b1、c、c1、c4、c6、d、o等；具有分支呼吸鏈；呼吸鏈組分隨環(huán)境條件改變；氧化磷酸化效率低下。NAD＋NADH2NADH2脫氫酶flavoproteinFes-proteinmenaquinoneCytochromeb556Cytochromeb558CytochromeoCytochromed1/2O2H2O1/2O2H2OE.coli中的分支電子傳遞鏈在有氧和缺氧時，可以選擇不同的途徑。高氧環(huán)境低氧環(huán)境NAD＋NADH2NADH2脫氫酶flavoproteinFes-proteinCytochromebCytochromecXCytochromeaa31/2O2H2O1/2O2H2O分支鏈呼吸的P/O值僅為正常呼吸鏈的1/3。在檸檬酸發(fā)酵時有調控作用。Aspergillusniger中的分支電子傳遞鏈厭氧呼吸是以無機物為最終電子受體的氧化作用。進行厭氧呼吸的方式一般有：硝酸鹽呼吸、硫酸鹽呼吸、延胡索酸呼吸、二氧化碳呼吸等。厭氧呼吸也需要細胞色素等電子傳遞體，并在能量分級釋放過程中伴隨有磷酸化作用，也能產生較多的能量用于生命活動。由于部分能量隨電子轉移傳給最終電子受體，所以生成的能量不如有氧呼吸產生的多。（二）厭氧呼吸(Anaerobicrespiration)1.硝酸鹽呼吸(nitraterespiration)硝酸鹽在微生物的代謝過程中，有兩種方式：一是將硝態(tài)氮(如NO3-)還原，轉化為氨態(tài)氮(NH4＋)，并進一步將它轉化為有機氨(R-NH3)構成蛋白質等生物大分子，稱為同化型硝酸鹽呼吸；二是將硝酸鹽逐級還原成NO2-、N2O和N2等氣態(tài)產物而逸去的異化脫氮過程，稱之為異化型硝酸鹽呼吸。2NO32NO22H2O[4H][HON=NOH]2H2O[4H]N2ON22NH2OH2NH3[4H][4H][2H]羥氨同化型硝酸鹽呼吸異化型硝酸鹽呼吸硝酸鹽還原酶(受O2阻遏)硝酸鹽呼吸AA進行硝酸鹽呼吸的細菌被稱為硝酸鹽還原細菌，進行硝酸鹽呼吸的都是兼性厭氧細菌，典型的如地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、脫氮硫桿菌(Thiobacillusdenitrificans)等，主要生活在土壤和水環(huán)境中。硝酸鹽還原細菌在無氧但環(huán)境中存在硝酸鹽時進行厭氧呼吸，而有氧時其細胞膜上的硝酸鹽還原酶活性被抑制，細胞進行有氧呼吸。

2.硫酸鹽呼吸(sulfaterespiration)硫酸鹽呼吸是微生物利用硫酸鹽(SO42-)作為有機基質厭氧氧化時末端電子受體的一類特殊呼吸。它是硫酸鹽異化型還原形成H2S的過程。硫酸鹽在微生物的代謝過程中，也有兩種方式：一是將硫酸鹽還原轉化為H2S，并進一步將它轉化為有機硫構成蛋白質等生物大分子，稱為同化型硫酸鹽呼吸；二是將硫酸鹽還原成S或H2S氣態(tài)產物而逸去的異化脫硫過程，稱之為異化型硫酸鹽呼吸。同化型硫酸鹽呼吸SO42－APSPAPSSO32－H2SATPATPCys、MetSer、HomSO32－AOCH2POHOH硫酸腺苷酰轉移酶APS激酶PAPS還原酶SO32-還原酶APS——硫酸腺苷磷酸SO32－AOCH2POHPAPS——磷酸硫酸腺苷磷酸P異化型硫酸鹽呼吸H22HHasecytC3MKcytbFdIIFrdSO42－APSSO32－H2SATPATP硫酸化酶APS還原酶SO32-還原酶H2HasecytC3FdIIFrd6H細胞膜細胞質周質空間脫硫脫硫弧菌(D.desulfuricans)中的異化型硫酸鹽呼吸PAPS同化型硫酸鹽呼吸微生物的不同呼吸類型根據(jù)微生物種類不同對氧的反應不同，可將微生物分為三種不同呼吸類型：①好氧性微生物；②厭氧微生物；③兼性厭氧微生物。為什么氧對厭氧微生物有有害作用？缺少以下兩種酶：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)過氧化氫酶(catalase)四、自養(yǎng)微生物的能量轉化1.自養(yǎng)微生物(autotrophs)的定義1887年Vinogradsky發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)微生物，1891年硅膠平板的使用，使更多的自養(yǎng)微生物得以發(fā)現(xiàn)。Vinogradsky標準：①無機物氧化是唯一的能量來源；②CO2是唯一碳源；③不利用有機物或有機物抑制其生長。20世紀50-60年代標準：除去第三條。現(xiàn)代標準：具有Rubisco及RuP激酶的微生物；如：甲基營養(yǎng)菌。2.自養(yǎng)微生物的種類化能無機營養(yǎng)菌光能無機營養(yǎng)菌甲基營養(yǎng)菌自養(yǎng)微生物硝化細菌硫化細菌氫細菌鐵細菌綠色細菌紫色細菌藍細菌嗜鹽細菌專性甲基營養(yǎng)菌兼性甲基營養(yǎng)菌（一）自養(yǎng)微生物的能量轉化方式1.化能無機自養(yǎng)菌(chemolithoautotroph,CLA)化能自養(yǎng)微生物從無機物的氧化中獲得能量，并能以CO2作為主要碳源或唯一碳源進行生長?；茏责B(yǎng)微生物都是好氧性細菌，根據(jù)它們生長時提供能源的無機物類型不同，可以將它們分成硝化細菌、硫化細菌、鐵細菌和氫細菌4種類型。真正屬于專性化能自養(yǎng)菌的種類并不多，不少種類屬于兼性自養(yǎng)或混合營養(yǎng)型。專性化能自養(yǎng)菌并非絕對不吸收有機物，而是能不同程度地同化有機物，進而將其轉化為細胞物質。但化能自養(yǎng)菌吸收的有機物不是作為能源，且數(shù)量有限，也不能代替CO2作為主要碳源?；茏责B(yǎng)菌通過氧化無機物獲得能量供其生長。其產生ATP的途徑仍為電子傳遞磷酸化和底物水平磷酸化兩種。亞硝化細菌的能量獲得方式膜氨單加氧酶(AMO)/羥胺氧化還原酶(HAO)/氨氧化細菌(AOB)硝化細菌的能量獲得方式NH3、NO2-的氧化還原電勢均比較高，以氧為電子受體進行氧化時產生的能量較少，而且進行合成代謝所需要的還原力需消耗ATP進行電子的逆呼吸鏈傳遞來產生，因此這類細菌生長緩慢，平均代時在10h以上。還原力的獲得方式——電子傳遞逆轉硫細菌的能量獲得方式

H2S→S0→SO32–→SO42–

硫細菌也是通過電子的逆呼吸鏈傳遞來生成還原力。S2-S2O32-硫化物氧化酶氰化酶2H[S]O24ATPH2O4H3H2O硫氧化酶SO32-1/2O22ATPH2O2HAMP+2H+APS還原酶SO32-亞硫酸鹽-細胞色素C還原酶SO42-APS2-SO42-PiADP硫化酶ADP1/2ATP1/2AMPPi腺苷酸激酶硫化菌氧化硫化物形成SO42-和產生ATP的基本過程H2O2H1/2O22ATPH2O2Fe2+2Fe3+RCCytCCyta11/2O2+2H+H2O周質空間PH4.5pH6.5pH2細胞膜細胞質2H+CytCADP+piATP氧化亞鐵硫桿菌氧化Fe2+的過程中的電子傳遞氫細菌的能量獲得方式顆粒狀氫化酶可溶性氫化酶氫細菌含有兩種與H2氧化有關的酶：一種為不需NAD+的顆粒狀氫化酶，它是含6個鐵原子和不穩(wěn)定硫的鐵硫蛋白，分子量≤90000。它結合在細胞質膜或壁膜間隙中。其作用是合成ATP。另一種是需要NAD+的可溶性氫化酶，它是一種寡聚鐵硫黃素蛋白，分子量約200000，含有幾個[2Fe-2S]、[4Fe-4S]中心和FMN，酶呈自由態(tài)溶于細胞質中。其作用是催化H2氧化形成NADH2，用于還原CO2。應用：1.硫桿菌產生的降解煤與石油中的無機及有機硫化物，以減輕酸雨的污染；2.硫桿菌產生的H2SO4可以使不溶性的CaCO3轉換成溶解度較大的CaSO4；3.利用硫桿菌產生的H2SO4溶解磷礦粉，增加磷礦粉的肥效；4.利用硫桿菌產生的H2SO4抑制非耐酸微生物的污染；5.最重要的應用是硫氧化細菌可以與鐵細菌一起特別是氧化亞鐵硫桿菌可以被用于細菌浸礦。2.光能無機自養(yǎng)菌(photolithoautotroph,PLA)光合微生物主要分為3大類群：綠色細菌、紫色細菌(分著色細菌和紅螺細菌)和藍細菌。細菌的光合色素主要為細菌葉綠素(Bacteriochlorophyll,B-Chl)，它的分子結構與高等植物相近。

環(huán)式光合磷酸化(cyclicphosphorylation)非環(huán)式光合磷酸化(noncyclicphotosphorylation)比較項目原核生物綠藻及高等植物紫細菌綠細菌藍細菌含有光合器

的細胞結構細胞膜色素囊類囊片和

藻膽蛋白類囊片光合系統(tǒng)Ⅰ十十十十光合系統(tǒng)Ⅱ——十十同化CO2

的還原劑H2S，H2，或有機質H2S，H2H2OH2O光合作用

的主要碳源CO2或有機質CO2

或有機質CO2CO2氧的產生－－＋＋3.嗜鹽菌(Halobacterium)嗜鹽細菌屬于極端微生物，它不含葉綠素或細菌葉綠素，依靠其特有的菌視紅質(Bacteriorhodopsins)進行光合作用。鹽生鹽桿菌(Halobacteriumhalobium)在低氧濃度下形成的菌視紅質是由7個α螺旋構成的穿膜結構，在560nm具有強烈的光吸收，而后驅動質子泵將質子抽到細胞膜外，造成內外質子的濃度差，從而形成ATP。嗜鹽細菌的能量獲得方式在海洋和淡水水體中，有一些細菌能發(fā)光。在一定條件下，發(fā)光細菌能將細胞內貯存的化學能轉化為光能。如海洋細菌中的費氏發(fā)光桿菌(Photobacteriumfischeri)就具有發(fā)光能力。發(fā)光機理：在特定條件下，發(fā)光細菌可在細胞內累積的某種物質的誘導下產生熒光素酶，該酶在有氧和長鏈脂肪醛(C12～14)存在的條件下，催化黃素單核苷酸(FMNH2)氧化，伴隨產生發(fā)光反應。發(fā)光后的產物為氧化型黃素單核苷酸(FMN)、長鏈脂肪酸和水。熒光素酶是細菌發(fā)光反應的關鍵酶，生物發(fā)光淀粉、纖維素、果膠、蛋白質、核酸等大分子化合物，必須在體外降解成可吸收的小分子單體，才能被微生物利用，這一過程不產能，但是為氧化還原做了準備。（一）淀粉的降解淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉之分。直鏈淀粉是以葡萄糖單體以α-1,4糖苷鍵連接而成；支鏈淀粉除了含有α-1,4糖苷鍵，還有分叉的α-1,6糖苷鍵。五.大分子化合物的降解glucoseglucose

α-1,4糖苷鍵淀粉的分解：是由微生物產生的淀粉酶催化完成的，因為淀粉是由許多葡萄糖分子聚合而成的，所以最終把淀粉分解，產生葡萄糖、麥芽糖等。主要淀粉酶的作用方式Starchdegradationbyamylolyticenzymes.Theopenandblackcolouredcirclesrepresentthereducingandnon-reducingsugars,respectively.Notethatthecleavageoccursatthereducingsugar.該酶攻擊淀粉分子內部α-1，4糖苷鍵，但對α-1,6糖苷鍵及靠近α-1,6糖苷鍵的α-1,4糖苷鍵無作用。作用的結果是產生麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。從非還原性末端開始以雙糖為單位水解α-1,4糖苷鍵，但β-淀粉酶不水解α-1,6糖苷鍵，遇到此鍵，作用停止。水解的終產物是麥芽糖、極限糊精(當支鏈淀粉水解一半時，反應停止時的剩余部分)及帶分支側鏈寡糖。

β-淀粉酶α-淀粉酶(α-amylase)

從非還原末端開始，依次以葡萄糖為單位水解α-1,4糖苷鍵，不水解α-1,6糖苷鍵，但能越過此鍵作用α-1,4糖苷鍵，作用產物是葡萄糖和帶有α-1,6糖苷鍵的寡糖。水解淀粉中的α-1,6糖苷鍵。它能水解α-淀粉酶和β-淀粉酶水解后的產物極限糊精，作用產物是葡萄糖。

葡萄糖淀粉酶淀粉-1,6-轉葡糖苷酶(異淀粉酶)支鏈淀粉直鏈淀粉表示帶有還原基的葡萄糖殘基Reducingtermini

Reducingtermini（二）纖維素的降解纖維素是地球上最豐富的多糖類化合物，是由許多葡萄糖分子聚合而成的長鏈大分子。許多微生物能夠分泌分解纖維素的酶，土壤微生物產生的纖維素酶分解農作物秸桿，最終產生葡萄糖。天然纖維素短鏈纖維素葡萄糖纖維二糖纖維寡糖纖維二糖葡萄糖C1酶C2酶β-葡萄糖苷酶按照纖維素酶的作用機理一般也可以將其分為三類：(1)內切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,(EC,也稱Cx酶);(2)外切β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC1,也稱C1酶);(3)纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21,簡稱CBH)。果膠質的分解：果膠質是構成植物細胞間質的主要物質，分解果膠的微生物主要是一些細菌和真菌，分解果膠質后產生一些有機酸和醇類化合物。幾丁質的分解：幾丁質又稱甲殼質，是真菌細胞壁和昆蟲體壁的組成成分，也是甲殼類動物，如蝦、蟹的外殼主要成分。它們是不易被分解的含氮多糖物質，一般生物都不能分解它，只有一些細菌和放線菌能分解和利用它。幾丁質首先被幾丁質酶分解成為甲殼二糖，后者被甲殼二糖酶分解成為N-乙酰氨基葡萄糖。（三）其他生物大分子的降解淀粉與幾丁質的結構StarchChitin半纖維素的分解：半纖維素的結構與組成隨植物的種類或存在部位不同而異，微生物分解半纖維素的酶也多種多樣。半纖維素分解后產生木糖、阿拉伯糖等等。木質素的分解：木質素是植物體內含量僅次于纖維素和半纖維素的一個組分，一般占植物干重的15～20%，在木材中可占30%左右。木質素的化學結構非常復雜，但在自然界中，仍然有一些微生物能夠分解該類物質，其中，以擔子菌的分解能力最強。擔子菌分解木質素時，還常同時分解纖維素、半纖維素等物質。脂肪的分解：微生物對脂肪的分解主要依賴于脂肪酶的作用，產生甘油和脂肪酸。在有氧條件下，脂肪酸可被徹底氧化成乙酰輔酶A，并釋放出大量能量。蛋白質的分解：蛋白質是由氨基酸組成的大分子量的化合物，種類繁多。微生物中產生的蛋白酶可將蛋白質分解為片段較小的肽，然后再由肽酶將肽分解成為氨基酸。微生物產生的蛋白酶大多數(shù)可以分泌到細胞外面，稱為胞外酶，但肽酶有胞外酶，也有不向外分泌而只存在于細胞內的胞內酶。微生物也能分解組成蛋白質的氨基酸，形成胺類和醇類。檸檬酸(Citric

acid)分子式為C6H807，易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有機溶劑，它天然存在于果實中。檸檬酸主要用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、風味增進劑、膠凝劑、調色劑等。檸檬酸1784年由Scheels發(fā)現(xiàn)，1893年Wehmer發(fā)現(xiàn)二種青霉菌可以生成檸檬酸，1917年Currie使用黑曲霉淺盤發(fā)酵生產檸檬酸，1938年Perquin和1942年Karrow進行了檸檬酸的深層發(fā)酵研究，1951年美國Miles公司首先以淀粉質為原料，經(jīng)水解后深層發(fā)酵大規(guī)模生產檸檬酸。第三節(jié)有機酸發(fā)酵一、檸檬酸發(fā)酵(酶學水平的調控)我國1953年采用淺盤法發(fā)酵生產檸檬酸，1968年用薯干為原料采用深層發(fā)酵法生產檸檬酸成功，至20世紀70年代中期，檸檬酸工業(yè)已初步形成了生產體系：產量位居世界第一；技術上處于世界領先水平，其優(yōu)勢：1.發(fā)酵采用的菌種(黑曲霉)具有雙重功能，采用邊糖化邊發(fā)酵工藝，降低了生產成本。2.檸檬酸的產酸速度大大高于國外水平，平均產酸速率是國外的2倍。

（一）檸檬酸發(fā)酵概述檸檬酸的消費領域：飲料行業(yè)占40～45％食品添加劑等占15～20％洗滌劑占20～30％醫(yī)藥占5％其它占10％我國是世界上最大的檸檬酸生產和出口國，檸檬酸年產能已經(jīng)達到百萬噸，占世界的70％左右；年產量達70余萬噸，約占世界的65％；年出口量50萬噸，超過世界貿易總量的一半。主要出口到印度、美國、歐洲、日本等地。在1970年時，我國的檸檬酸年產僅有130噸。（二）檸檬酸發(fā)酵微生物

在固體培養(yǎng)基上，黑曲霉菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產生一串串分生孢子。1.黑曲霉(Aspergillus

niger)的形態(tài)特征

目前生產上常用產酸能力強的黑曲霉作為