基因表達(dá)的定量檢測(cè)分析

基因表達(dá)的定量檢測(cè)分析第1頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因表達(dá)的定量檢測(cè)分析第2頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因表達(dá)的定量檢測(cè)方法1.蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：1）定量檢測(cè)分析：westernblotting、ELISA、HPLC2）蛋白質(zhì)功能分析：

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析：免疫熒光技術(shù)

蛋白相互作用研究：酵母雙雜交、免疫共沉淀（IP）、

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

酶活性檢測(cè)：ELISA、HPLC2.mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：1）半定量RT-PCR2）Northernblot

3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealtimePCR）

第3頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Northernblot雜交

是用來(lái)檢測(cè)真核生物RNA的表達(dá)量和大小，以估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法，可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RNA的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，

要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布4.將RNA固定到支持物上（UV交聯(lián)）5.固相RNA與探針?lè)肿樱―NA或RNA）雜交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿?.對(duì)特異結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析第4頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RealtimePCR第5頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。第6頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。第7頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：

熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。第8頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。

而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。

只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和

CT值。

熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值（thresholdvalue）第9頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四幾個(gè)常用名詞概念1.Ct值的定義

C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值），Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第10頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.熒光域值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-153.Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第11頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的

最初階段第12頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四絕對(duì)定量分析：

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系第13頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用第14頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第15頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四相對(duì)定量分析必須用內(nèi)對(duì)照基因（管家基因）進(jìn)行校正，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。管家基因：維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等第16頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第17頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第18頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第19頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第20頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第21頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第22頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第23頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第24頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第25頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜，使用方便，不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針。缺點(diǎn)：無(wú)模板特異性，對(duì)引物特異性要求比較高，

不能進(jìn)行多重定量分析第26頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第27頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第28頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四TaqmanProbeMolecularBeacon背景熒光更低第29頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四反應(yīng)優(yōu)化反應(yīng)液組成、體積50ul絕對(duì)不必要20ul應(yīng)用廣，但成本高推薦10ul，但需要優(yōu)化引物與引物、引物與探針濃度配比4×4組合，50nm,300nm,600nm,900nm探針50nm,100nm,250nm

第30頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四qPCR一般使用二步PCR擴(kuò)增，在退火-延伸整合步驟結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。當(dāng)PCR反映效率低時(shí)可以使用三步PCR擴(kuò)增。染料法可以在72℃延伸結(jié)束時(shí)檢測(cè)。探針?lè)ㄖ荒茉谕嘶鸾Y(jié)束時(shí)檢測(cè)。第31頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第32頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第33頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第34頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第35頁(yè)，共41頁(yè)，2023年，2月20日，星期