DB2310T 007-2019黑木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20B05牡丹DB2310江市地方標準DB/T007—2019牡丹江市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB2310/T007—2019前言本標準依據(jù)GB/T1.1-2009的編寫規(guī)則起草。本標準由黑龍江省食用菌標準化技術(shù)委員會牡丹江分委員會提出并歸口。本標準起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院。本標準主要起草人：王延鋒、于海洋、張運岐、羅連富、賈利陽、楊峰山、丁仕波、史磊、張榮芳、高天一、董雪梅、王金賀、劉姿彤、谷維、潘春磊、盛春鴿、張鵬、宋佳鑫、趙鶴、趙靜。1DB2310/T007—2019黑木耳液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程1范圍菌種保藏及運輸、記錄與檔案。本標準適用于黑木耳液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB150壓力容器GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準GB/T12728食用菌術(shù)語GB/T13554高效空氣過濾器GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準GB22207容積式空氣壓縮機安全要求GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T2375食用菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1經(jīng)不同方法選育出來的具有特異性、遺傳型、穩(wěn)定性，適用于液體發(fā)酵、固體栽培的食用菌菌種。3.2黑木耳液體菌種用液體培養(yǎng)基，在生物發(fā)酵罐中，通過深層培養(yǎng)(液體發(fā)酵)技術(shù)生產(chǎn)的液體形態(tài)的黑木耳菌種。3.3液體菌種發(fā)酵罐也稱之為食用菌液體菌種培養(yǎng)器，是指進行食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用設(shè)備。要求不銹鋼材質(zhì)，符2DB2310/T007—2019合GB150要求。3.4起始pH液體培養(yǎng)基配制后尚未滅菌的pH。3.5終止pH液體菌種達到放罐指標時的培養(yǎng)基pH。3.6發(fā)酵罐空消對尚未投料的空發(fā)酵罐進行高壓蒸汽滅菌。3.7發(fā)酵罐實消對投料后的發(fā)酵罐及發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌。3.8接種量接入發(fā)酵罐中的食用菌菌種的數(shù)量，以菌種體積與培養(yǎng)基體積的百分比表示。3.9通風量發(fā)酵罐培養(yǎng)液體菌種過程中每分鐘通入培養(yǎng)基的無菌空氣的量，以培養(yǎng)基體積/通入空氣體積表示。3.10液體菌種菌齡指菌種接入培養(yǎng)基后，液體菌種的生長發(fā)育時間。3.11放罐液體菌種菌絲生長旺盛，達到生長對數(shù)期時結(jié)束培養(yǎng)，在無菌條件下從發(fā)酵罐通過傳送管在0.15MPa壓力下，注射接種到栽培袋中。3.12鏡檢指通過顯微鏡觀察液體菌種的菌絲生長發(fā)育狀態(tài)以及是否有雜菌污染。4生產(chǎn)條件4.1廠址選擇3DB2310/T007—2019應(yīng)建立在交通便利，地勢干燥，通風良好，水源充足，遠離禽畜舍、垃圾堆積場，無污水、廢氣、廢渣和粉塵等污染源。水質(zhì)應(yīng)符合GB5749的規(guī)定；大氣應(yīng)符合GB3095的規(guī)定；土壤環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB8的規(guī)定。4.2廠房設(shè)置和布局液體發(fā)酵間和接種間按照GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范執(zhí)行，應(yīng)按液體菌種生產(chǎn)工藝流程合理安排布局，無菌區(qū)與有菌區(qū)有效隔離。4.3基礎(chǔ)設(shè)備菌種配制室、滅菌室、無菌凈化操作室、恒溫培養(yǎng)室、發(fā)酵罐培養(yǎng)室、化驗室和菌種室，要有調(diào)溫設(shè)施，排水系統(tǒng)，排氣設(shè)備，進入無菌區(qū)緩沖間，規(guī)模要配套，布局合理。4.4生產(chǎn)儀器和設(shè)備T凈化工作臺、冰箱、磅秤、天平、液體菌種接種槍、恒溫回旋式振蕩器應(yīng)符合相關(guān)的使用規(guī)定。4.5檢驗設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、酸度計等、玻璃三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、定量定性濾紙、精密pH試紙。5菌種選擇應(yīng)選用適于當?shù)卦耘?、發(fā)菌出耳及轉(zhuǎn)潮快、抗逆性強、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、商品性好，經(jīng)省級以上農(nóng)作物品種審定委員會審(認)定的品種。菌種生產(chǎn)應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。6液體菌種生產(chǎn)技術(shù)要求6.1工藝流程生產(chǎn)。4DB2310/T007—2019程6.2母種制備6.2.1母種培養(yǎng)基的制作按照附錄A.1配方配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)或附錄A.2配方配制綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CPDA)，分裝至試管長度五分之一處，使用棉塞或膠塞封住試管口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，溫度121℃，滅菌30min，滅菌結(jié)束擺放斜面冷卻凝固。6.2.2接種與培養(yǎng)無菌條件下，用接種鉤取黃豆粒大小的原始菌種接種在母種培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度避光培養(yǎng)10d-15d。6.3搖瓶菌種制備6.3.1搖瓶培養(yǎng)基的制作BGBminminL用封口膜封口，滅菌壓力為0.125Mpa，滅菌時間40min。滅菌時加蓋牛皮紙防潮。6.3.2接種與培養(yǎng)無菌條件下，用接種鏟將母種接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶接15-20塊，接種完成貼好標簽置于25℃培養(yǎng)溫度為25℃-28℃。培養(yǎng)期間定期檢查，除去污染或異常菌種，并留樣用于檢測。6.4液體菌種制備6.4.1投料前準備檢查發(fā)酵罐罐體有無變形，全部閥門、壓力表、控制面板，有內(nèi)置電加熱棒的發(fā)酵罐，加熱棒是否完好，有無漏電，是否能夠正常工作。對罐體內(nèi)、外用流水進行沖洗，達到無死角、內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物。5DB2310/T007—2019發(fā)酵罐每次使用前要對罐體進行空消，有內(nèi)置加熱棒的空消時加水必須沒過加熱棒，121℃-124℃滅菌60min；用外源蒸汽滅菌的發(fā)酵罐，蒸汽壓力達到0.105Mpa-0.125Mpa，121℃-124℃滅菌40min。6.4.2液體培養(yǎng)基的制作6.4.3投料與定容將原材料用冷水溶解，倒入或用泵抽入發(fā)酵罐中，加水定容至罐體規(guī)定體積，如果用到馬鈴薯等固體原料需要提前用開水煮沸30min，宜用三層紗布過濾，再將濾液與其他培養(yǎng)料攪拌均勻。6.4.4起始pH6.4.5發(fā)酵罐實消發(fā)酵罐內(nèi)蒸汽壓力達到0.125Mpa，溫度達到124℃時，內(nèi)置罐需下排料1次，外置罐需要上下排料各1次，滅菌時間保持60min，溫度上升過程需將排氣閥微開防止罐體內(nèi)形成假壓，保壓過程保持排氣閥微開。6.4.6冷卻滅菌結(jié)束后將冷水通入發(fā)酵罐夾層或內(nèi)置冷卻系統(tǒng)中循環(huán)降溫，降溫過程中向發(fā)酵罐內(nèi)通入無菌空氣同時打開排氣閥，培養(yǎng)基溫度降溫至24℃-28℃停止通入冷凝水，罐內(nèi)壓力維持在0.05Mpa。6.4.7接種按下列步驟完成：a)用無菌水噴灑發(fā)酵罐上方進行降塵處理；b)在接種口放置內(nèi)徑略大于接種口并蘸有95%酒精的紗布火焰圈，點燃火焰圈；c)調(diào)節(jié)壓力表，使發(fā)酵罐內(nèi)壓降至0.01Mpa，打開入料口同時關(guān)閉排氣閥，火焰旁打開已經(jīng)表面消毒的搖瓶菌種封口膜，灼燒瓶口后迅速將菌種倒入發(fā)酵罐中；d)用火焰外焰灼燒接種口蓋，迅速擰緊，移走火焰圈同時打開排氣閥，調(diào)整壓力表保持發(fā)酵罐壓力6.4.8液體菌種培養(yǎng)培養(yǎng)階段應(yīng)滿足下列條件：b)罐壓保持在0.03Mpa-0.05Mpa；6.4.9液體菌種檢測取樣：接種1d后進行隔天檢測，用酒精燈外焰灼燒取樣閥，棄掉最初流出液體，取一定量的液體流入無菌三角瓶中，備用。6DB2310/T007—2019檢測：將樣品在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察是否有雜菌污染，無雜菌污染觀察菌落生長情況，達到6.5留樣菌種和培養(yǎng)基均應(yīng)留樣備查：b)搖瓶菌種使用時取樣30mL-40mL，用三角瓶留存；c)發(fā)酵罐實消后的空白培養(yǎng)基取樣30mL-40mL，用三角瓶留存；e)發(fā)酵終止后取樣80mL-100mL，用三角瓶留存。7菌種保藏及運輸液體菌種生產(chǎn)好后，應(yīng)立即進入菌種生產(chǎn)或栽培袋接種使用，若因某些原因不能立即使用時需降溫保壓處理。一般在4℃－10℃下存放不超過2d。液體菌種不宜長途運輸。8記錄與檔案應(yīng)建立生產(chǎn)檔案，內(nèi)容包括產(chǎn)地環(huán)境、品種選擇和質(zhì)量要求，母種、搖瓶液體種和發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)等。生產(chǎn)記錄由具體操作人員現(xiàn)場記錄填寫，定期由主管領(lǐng)導(dǎo)審核，簽字后歸檔，檔案保存7DB2310/T007—2019(規(guī)范性附錄)常用母種培養(yǎng)基及配方A培養(yǎng)基(PDA)配方：馬鈴薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，瓊脂20g，水定容至A.2綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CPDA)配方：馬鈴薯200g(浸出汁)，葡萄糖20g，瓊脂20g，磷8DB2310/T007—2019B(規(guī)范性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)基參考配方AmL。9DB2310/T007—2019(規(guī)范性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)放罐指標項目指標發(fā)酵液色澤球狀菌絲體因品種而異，一般呈白色，濾液呈淡黃色或黃褐色，清澈透明。菌液形態(tài)菌液稍粘稠，菌絲體稠密且均勻分布，菌液不混濁。菌液氣味無酸、臭味、霉味、發(fā)酵酒精味等異味。pH5.5-6.0。顯微鏡下菌絲形態(tài)黑木耳菌種液體培養(yǎng)中特有的球狀和從狀菌絲形態(tài)，菌絲粗壯，分布均勻樣品無菌檢查無霉菌、細菌、酵母菌等雜菌菌落生長DB2310/T007—2019D(資料性附錄)黑木耳液體菌種培養(yǎng)檢驗項目項目指標檢驗方法菌液顏色和透明度呈淡黃色或黃褐色，清澈透明。感官鑒定菌液形態(tài)菌液稍粘稠，菌絲體稠密且均勻分布，菌液不混濁。感官鑒定菌液氣味無酸、臭味、發(fā)酵酒精味等氣味。感官鑒定菌絲形態(tài)可見黑木耳菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，大量分枝菌絲分布，菌絲纖細，有鎖狀聯(lián)合，菌絲內(nèi)原生質(zhì)分布均勻、染色劑著色深。顯微鏡(低倍鏡、高倍鏡、