免疫組化操作規(guī)程

免疫組化操作規(guī)程、儀器設(shè)備 1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；2)水浴鍋、試劑PBS緩沖液(pH7.2?7.4)：NaCl137mmol/L,KC12.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L。0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml)：檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g。0.5mol/LEDTA緩沖液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O,用10mmol/LNaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7)封裱劑：a、 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0?9.5)等量混合；b、 油和TBS(或PBS)配制。8)TBS/PBSpH9.0?9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本；pH7.0?7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。、操作流程1、 脫蠟和水化脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60r恒溫箱中烘烤20分鐘。組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘；無水乙醇中浸泡5分鐘；95%乙醇中浸泡5分鐘；70%乙醇中浸泡5分鐘；2、 抗原修復(fù)用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。1)抗原熱修復(fù)高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。煮沸熱修復(fù)電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95r左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。微波熱修復(fù)在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘,反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,ChromograninA,Cyclin,ER,Heatshockprotein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,Topoismerasell等。2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37r,切片也預(yù)熱至37r,消化時間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37r時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。3、免疫組織化學(xué)染色SP法脫蠟、水化；PBS洗2?3次各5分鐘；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗2?3次各5分鐘；5）抗原修復(fù)；6） PBS洗2?3次各5分鐘；7） 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。8） 滴加I抗50卩1，室溫靜置1小時或者4°C過夜或者37°C1小時。9） 4°C過夜后需在37C復(fù)溫45分鐘。10） PBS洗3次各5分鐘；11） 滴加II抗40?50卩1，室溫靜置，或37C1小時；12） II抗中可加入0.05%的tween-20。13） PBS洗3次各5分鐘；14） DAB顯色5?10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15） PBS或自來水沖洗10分鐘；16） 蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；17） 自來水沖洗10?15分鐘；18）脫水、透明、封片、鏡檢。SABC法1）脫蠟、水化。2） PBS洗兩次各5分鐘。3） 用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5?10分鐘，蒸餾水洗3次。4） 抗原修復(fù)。5） PBS洗5分鐘。6） 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7） 滴加I抗，室溫1小時或者4°C過夜或者37C1小時（4°C過夜后在37C復(fù)溫45分鐘）。8） PBS洗三次每次2分鐘。9） 滴加生物素化二抗,20°C?37°C20分鐘。10） PBC洗3次每次2分鐘。11） 滴加試劑SABC,20C?37°C20分鐘。12） PBS洗4次每次5分鐘。13） DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14） 蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。15） 脫水、透明、封片、鏡檢。石蠟切片免疫組化染色步驟1、 載玻片的處理：抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進(jìn)行，APES、Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。2、 常用酶消化：胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37C、10~40分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37C、30~180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），CollagenIV（IV型膠原）等。2.3皂素（Saponin）：—般使用濃度為2?10口g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。3、抗原熱修復(fù)：可根據(jù)實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0±0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調(diào)整。3.1石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘x3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92°C?98°C之間并持續(xù)10?15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10?20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml?3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5?6分鐘后），計時1?2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘x3,下接免疫組化染色步驟。3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92C~98C起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。4、免疫組化染色步驟： （以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）4.1石蠟切片免疫組化染色步驟石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。5~10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37C孵育1~2小時或4°C過夜。PBS沖洗，5分鐘x3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37C孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37C或室溫孵育10~30分鐘。PBS沖洗，5分鐘x3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37C孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37C或室溫孵育10~30分鐘。PBS沖洗，5分鐘x3次。⑩顯色劑顯色（DAB或AEC）。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。4.2冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片4?8口um,室溫放置30分鐘后，入4°C丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘x20下接免疫組化染色操作步驟。免疫組化常見問題的處理當(dāng)免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。對照/標(biāo)本無染色確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4?8°C條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。檢查標(biāo)本的儲存條件，最好用已知陽性的標(biāo)本來同時做陽性對照。檢查色原/底物溶液，最簡單的檢測方法是將一滴標(biāo)記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。弱陽性如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定?？贵w的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度。切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。非特異性染色是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對于內(nèi)源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。處理的方法為：滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6?8.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。飽和處理內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內(nèi)源性生物素，使之不再有剩余的結(jié)合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常應(yīng)用。另外，取材時避開出血、壞死區(qū)亦極重要。最近有些國內(nèi)的實驗室應(yīng)用5%脫脂奶粉替代血清進(jìn)行抗原封閉，效果也不錯。所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。一抗的使用濃度是否過高。清洗是否充分。應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/lTris—HCl,0.15mol/lNaCl已適用于多數(shù)染色方法，溶液內(nèi)加入吐溫20,效果更佳。特殊標(biāo)記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型DAB試劑盒時，請嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值，以確保實驗結(jié)果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將DAB保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。標(biāo)本染色過程中是否曾經(jīng)干涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)。免疫組化染色過程中存在的問題、原因分析及對策良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題，但從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無色片（即無陽性信號）和“雜音”染色片（有陽性信號）。一、無色片染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規(guī)工作中比較常見的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：1、真陰性結(jié)果：整個染色過程沒有出現(xiàn)問題，組織或細(xì)胞確實不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是病理醫(yī)生選擇錯了切片或抗體選錯了，要麼是技術(shù)員選錯了蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事，病理醫(yī)生也起著不可缺少的作用。（2）染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結(jié)束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現(xiàn)任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗DAB或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因。解決陰性染色的問題非常簡單，就是設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達(dá)，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應(yīng)一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內(nèi)部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時最好選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實際工作中需要設(shè)立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題，目前國內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續(xù)切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數(shù)常用的抗體。設(shè)立陽性對照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對照，如果沒有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽性對照。因此，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可忽視的?？贵w未覆蓋上測試組織：當(dāng)多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。二、“雜音”染色片免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說明，筆者將其歸納為下面幾種。、全片著色全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法Polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。、DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機(jī)時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時間過長。、組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長(大于24小時)：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4°C冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。(6)、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。、切片邊緣著色切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：(1)、組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片(APES或多聚賴氨酸)，切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。(2)、切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用DAKO筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。3、“陰陽臉”著色指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。有時，用DAKO（或PAP）筆在組織周圍畫圈時，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達(dá)到靠近劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時手法要輕，有氣泡時用牙簽捅破。4、灶片狀著色切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問題的原因有：（1）、裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。（2）、壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。（3）、制作APES膠片時，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95m1）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2mlAPES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37°C過夜干燥、室溫儲存?zhèn)溆?。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時可適當(dāng)加入一些丙酮。5、 間質(zhì)著色著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)