細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法NEW

細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法NEW細(xì)胞培養(yǎng)基的種類繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及最大程度地保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)工作者都很重要。培養(yǎng)基的使用依據(jù)不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類的不同而存在差異。1細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長(zhǎng)的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。1.1細(xì)胞培養(yǎng)基&血清模式血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來說是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的全部營(yíng)養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5%?10%的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3%左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。圖1BHK21-13第14代，MEMSLM培養(yǎng)基（SLM120）+3%NBS,100X注：SLM120為清大天一公司低血清培養(yǎng)基，左為培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞密度，右為48小時(shí)細(xì)胞密度。血清可在培養(yǎng)基滅菌后加入，也可與培養(yǎng)基混合后一起過濾。血清的添加一方面補(bǔ)充了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖所需的一些因子（如生長(zhǎng)因子等），另一方面也增加了培養(yǎng)基的黏滯度，這樣可以降低細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中或被胰蛋白酶消化后的損傷。但是血清的加入也帶來了很多問題，血清都是批量生產(chǎn)，各批之間差異很大，血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶、補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。血清質(zhì)量問題還會(huì)對(duì)接種病毒以及毒價(jià)產(chǎn)生影響，例產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。1.2細(xì)胞培養(yǎng)基&乳歐液模式化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白（LactalbuminHydrolysate）仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’BSS）或歐式（Earle’sBSS）平衡鹽溶液溶解水解乳蛋白（一般為5%。濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。水解乳蛋白為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細(xì)菌微生物培養(yǎng)，又可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為0.5%水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM）按1:1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于地鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先由于水解乳蛋白來源于動(dòng)物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質(zhì)。任何一種傳染源都可能對(duì)正在生長(zhǎng)的細(xì)胞系或者制品帶來風(fēng)險(xiǎn)。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對(duì)于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因?yàn)橛脛?dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，例如動(dòng)物肽類物質(zhì)的引入，勢(shì)必會(huì)增加提取、分離、純化步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì)影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。1.3細(xì)胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長(zhǎng)因子等）模式成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。激素和生長(zhǎng)因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素（包括50ng/ml的生長(zhǎng)激素和1-10U/ml的胰島素），它們能增加多種不同類型細(xì)胞的貼瓶率；氫化可的松能提高膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的克隆形成率。生長(zhǎng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。2細(xì)胞培養(yǎng)基配制2.1十粉培養(yǎng)基原倍液的配制（1） 配制過濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基1） 閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、 HEPES等）。2） 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20°C?30°C）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。3） 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。4） 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。5） 用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。6） 用0.22〃m濾膜正壓過濾除菌。7） 溶液應(yīng)在2C-8C下避光保存。具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。（2） 配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基1） 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20C?30C）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。2） 在121C、15psi下滅菌15分鐘。3） 待溶液冷卻全室溫，加入無菌0.2mol/LL-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5%（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20C?30C）全規(guī)定體積，混勻。4） 如果必要，用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。5） 溶液應(yīng)在2C-8C下避光保存。具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。3注意事項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水(經(jīng)石英蒸餾器蒸餾)或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90%—95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。如需添加的組分較多時(shí)，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。由于除菌過濾后，pH值可能會(huì)升高0.1?0.2個(gè)單位，因此在過濾前，可將pH調(diào)至比所需值低0.1?0.2個(gè)單位。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。建議用1NHCl或1NNaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c調(diào)pH值對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：M一加T.5處碳酸氫鈉的重—-加INNaOH^B加碳酸氫鈉后所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓加氫氧化鈉后所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓圖2MEMSLM(SLM120)在相同pH值時(shí)所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量

及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓播一加T.5W碳酸氫鈉的魚J加INNaOHfi^B—加碳酸氫鈉后所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓加氫氧化袖后所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)就卷透壓圖3199（MD502）在相同pH值所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓4滅菌方法培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強(qiáng)度小，成本較低，但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣（無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等）過程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1?0.2〃m孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。4.1高壓滅菌某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。這類培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121°C、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到滅菌效果及營(yíng)養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵。4.2過濾滅菌可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。一般情況下采取正壓過濾，正壓過濾較之負(fù)壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染，可避免蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡等優(yōu)點(diǎn)。一般使用過濾器可參照各供應(yīng)商的產(chǎn)品說明書。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和制藥企業(yè)采用微孔濾膜濾器（如Zeiss濾器）或立式微孔濾器（Millipore、Pall）除菌。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放0.22um濾膜。使用這種濾器最重要步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。如在使用Zeiss濾器時(shí)，先要用培養(yǎng)用水將濾膜充分潤(rùn)濕，在安裝濾膜時(shí)可在其上放置一層定性濾紙?jiān)俟潭āＯ緯r(shí)旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好（可用牛皮紙、紗布、無紡布等）；高壓滅菌后，在無菌環(huán)境中立即將旋鈕扭緊。過濾除菌結(jié)束后，要打開濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進(jìn)行過濾除

菌過程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因?yàn)闉V膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。5細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2—8°C、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn).八、、：過濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2?3周內(nèi)使用完。滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4C保存6?9個(gè)月，也可冷凍保存，用時(shí)解凍。高壓除菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置4C保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢?chǔ)存溫度。添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)液放置2周后，要補(bǔ)加和原來同樣量的谷氨酰胺，但這樣并不能消除谷氨酰胺降解產(chǎn)生的游離氨，建議配制好的培養(yǎng)液盡快使用。6S10 12 146S10 12 14Ifi1820 22螺*：圖4pH為7.6時(shí)不同溫度2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性圖5室溫下不同pH時(shí)10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性（5）添加某些生長(zhǎng)因子、激素等添加物，可能會(huì)改變培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件，比如溫度、時(shí)間等方面的要求。細(xì)胞培養(yǎng)基從1903年開始發(fā)展到現(xiàn)在，有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，還有低血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無血清細(xì)胞培養(yǎng)基甚至無蛋白培養(yǎng)基，種類繁多、各具特點(diǎn)。在使用過程中，只有根據(jù)各類細(xì)胞培養(yǎng)基的特性、特點(diǎn)正確的選擇配制方法、滅菌方法、儲(chǔ)存方法，才能最大程度地保持細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)，發(fā)