定點突變與重組蛋白表達

定點突變與重組蛋白表達第1頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四DNArecombination,

將不同來源的DNA片段通過末端共價連接形成重新組合的DNA分子的過程。Genecloning,在體外對DNA分子按照既定的目的分離，剪切和重新連接，構成重組的DNA分子，并在特定的受體細胞中，與載體一起得到復制和表達，從而獲得該分子的大量拷貝。第2頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四AspecificDNAfragmentisisolatedfromlarge

genomicDNAandligatedtoavectorDNA(relativelysmall)byusingrestrictionenzymesandligases;Therecombinant(hybrid)DNAmoleculeisthendeliveredintoahostcell(oftenbeingE.colicells)andamplifiedaccompanyingcellpropagation.第3頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

第一節(jié)工具酶及載體限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases）Restrictionenzymes(通常是二聚體)能識別并且切割特定的具有回文結(jié)構的序列(HamiltonSmith,1970);能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點并且裂解磷酸二酯健。第4頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四根據(jù)酶結(jié)構，識別切割序列上的特異性，催化條件及修飾活性等分為：

I型多亞基蛋白復合物，兼具限制酶甲基化酶活性，需Mg,ATP,SAMII型識別切割具極強特異性。由兩個亞基組成，需MgIII型相當少，有兩個亞基，切割缺乏特異性第5頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四SometypeIIrestrictionenzymescleavebothDNAstrandsatthesamesiteleavingtwobluntendswithoutunpairedbasepairs,OthertypeIIrestrictionenzymesmakestaggeredcutsonthetwoDNAstrandsleavingtwocohesiveends(withprotrudingsinglestrand)whichcanformbasepairwitheachotherorwithanyotherDNAfragmentswithcomplementarycohesiveends;PstI5-CTGCAG-35-CTGCAG－33-GACGTC-53-GACGTC－5第6頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四限制酶反應的影響因素

1.溫度一般37℃，也有例外SmaI為25℃。

2.緩沖液不同的酶對離子強度，pH有不同要求

3.時間通常1－1.5hr4.反應體積加酶體積一般為總反應體積1／105.DNA的純度和結(jié)構第7頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四二.連接酶和末端轉(zhuǎn)移酶TwodifferentDNAmoleculescutwiththesameorcompatiblerestrictionenzymescanbeligatedintoonerecombinantDNAmoleculebyusingDNAligases;T4-DNAligaseThefirstrecombinantDNAmoleculewasmadewithlphageandSV40DNAmoleculesbyusingterminaltransferasetomakestickyendsontwodifferentDNAmolecules(PaulBerg,1972).第8頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四三.載體（vector)質(zhì)粒

染色體外能自主復制的共價雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，廣泛存在于原核細胞內(nèi)。質(zhì)粒DNA的大?。?—200kb

小的能編碼2－3種中等大小的蛋白質(zhì)，其分子量約為106dal，而大的質(zhì)粒分子量則可高達108dal

第10頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

分子量相對較小具有可供選擇的遺傳標志有盡可能多的限制酶切點具復制起點，能自主復制Plasmidvectorsmustatleastcontain:areplicationorigin,anantibioticresistancegene(functionasaselectablemarker),andarestrictionsitewhereforeignDNAcanbeinserted(upto15kbcanbecloned);

第11頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.噬菌體BacteriophagelcloningvectorscanbeusedtoclonelargerDNAfragments,wheretherecombinantDNAispackedintophageparticlesinvitroandthenbedeliveredintoE.colicellswithhighefficiency(upto23kbcanbecloned);插入型載體,容量較小，gt11

具有一個限制酶位點可供外源DNA片段插入；容量為0～12kb。置換型載體

具有成對的限制酶位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代；容量為9～23kb第13頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四UsingbacteriophagelDNAascloningvectorinE.colicells.OnlyrecombinantofappropriatesizeandhavingthetwoessentialphageDNAfragmentswillbepackedintophageparticlesEnterE.colicells第14頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四ADVANTAGESOFTHElSYSTEM1.Largeinsertspossible(upto20kb).2.Stablepropagation(C.F.plasmidswherelargeinsertsmaygetdeleted).3.Efficiententryintocellusingin

vitropackaging.4.Multiplecopiesofinsertandstrongpromoters.DISADVANTAGESOFTHElSYSTEM1.Plaquesareproducednotcolonies.UsefulforcloningDNAbutnouseforgeneexpression,ductionofgeneproductsinbiotechnology.2.20kbisstillnotlargeenoughformanyeukaryoticgenes.Forlargerinsertscosmidsoreukaryoticvectorscanbeused.第16頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3.黏性質(zhì)粒

含有l(wèi)噬菌體的黏性末端有質(zhì)粒的抗藥性標記特點具多個MCS

本身分子量小，可容納45kbDNA

體外包裝主要是重組體，利于篩選CosmidvectorscontainfeaturesofbothplasmidandphageacceptingevenlargerDNAfragments(upto45kb).第17頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Artificialconstructions.ConsistofthecosendsofphagewithplasmidDNA.InvitropackagingisusedtointroducetheDNAintoahostcell.AnyDNAbetween2cossiteswillbepackagedinthephagehead.PhageinjectstheDNAwhichthenbehaveslikeaplasmidonceinsidethehostcell.Butsuch"phages"arenotvirulentanddonotcauselysisorproduceplaques.Coloniesareproduced.Thereforegeneexpressionandproductionispossible.Insertsupto40kbcanbeinserted.Selectioncanbebyaddingampicillinresistancegenetoinsert-positiveselectiononampicillinplates.However,cosmidscanbeunstable.第18頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四ThecosmidDNApropagatesasaplasmidinE.colicellsLargeoneswillbepackedintophageparticlesSmalloneswillbetransformedintoE.colicells.Forpackagingintolphageparticles第19頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四4.表達載體（expressingvector)

用來在宿主細胞中表達外源基因的載體，除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。原核細胞表達載體，E.coli

真核細胞表達載體

yeast,mammaliancell第20頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

制備目的基因構建重組體將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞重組體的篩選和鑒定重組體的擴增和表達基因克隆的基本程序第二節(jié)基因重組第21頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四一.目的基因的制備1.Genesareisolatedfromagenomiclibrary基因文庫

是收集來源于某種有機體基因組DNA的所有片斷(通過某種限制性內(nèi)切酶切割后,e.g.,Sau3A)，分別將這些片斷連接到克隆載體中(質(zhì)粒,l噬菌體,cosmid,orYAC);第22頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四基因文庫要包含所有的編碼和非編碼DNA序列.侵染E.coli

細胞獲得嗜菌斑由l

載體構建基因文庫第23頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.GenesareisolatedfromacDNAlibrarycDNA文庫是收集所有來源于某種有機體、某種細胞或組織mRNAs的DNA分子片斷(用反轉(zhuǎn)錄酶從互補DNA轉(zhuǎn)化而來,亦稱cDNA,)而建立起來的。

AcDNAlibraryisa(complete)collectionofDNAfragmentsderivedfromthemRNAs(convertedtotheircomplementaryDNA,orcDNA,usingreversetranscriptase)ofaparticularorganism,certaincellsortissuesofanorganism.第24頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四AcDNAlibraryisgeneratedfromamRNA“l(fā)ibrary”fromacertainsource.InsertintoacloningvectortomakeacDNAlibrary.第25頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3.SpecificDNAsequencescanbeamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)ApairofoligonucleotideprimerscomplementarytotheflankingregionsofthetargetDNAhavetobesynthesizedRepeated(usuallyabout30cycles)chainseparationandDNAsynthesis(usingthethermostableTaqDNApolymerase)willamplifythetargetDNAmillionsoffold;ThePCRtechnique,inventedbyKaryMullisin1984,causedarevolutionforDNAdetectionandmanipulation.第26頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四4.Genearesynthesizedbychemicalmethod第28頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四二.目的基因與載體重組黏性末端連接平端連接人工頭連接同聚物加尾連接第29頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第30頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四三.重組DNA導入宿主細胞Transformation轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒及重組體導入細菌Transfection轉(zhuǎn)染，病毒及重組體導入宿主細胞Transduction轉(zhuǎn)導，噬菌體及重組體導入宿主細胞第31頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1.氯化鈣法特點：轉(zhuǎn)化率低2.電穿孔法特點：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高；穿孔條件難掌握，細胞殺傷率高3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法特點：轉(zhuǎn)化率最高，但脂質(zhì)體昂貴4.顯微注射法特點：儀器昂貴，操作需熟練第32頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四四.重組體的篩選和鑒定1.遺傳學方法插入失活,藍－白篩選2.限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定3.核酸雜交法－原位雜交4.PCR篩選法5.免疫化學篩選法第33頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)定點突變寡核苷酸介導的基因突變盒式突變或片段取代突變PCR定點突變隨機突變基因突變位點特異性突變第35頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四定點突變(site-directedmutagenesis)在體外特異性改變某個堿基的技術第36頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule.

第37頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四site-directedmutagenesistheresearcherscanstudyindetailhowproteinsfunctionandhowtheyinteractwithotherbiologicalmolecules.Site-directedmutagenesiscanbeused,forexample,tosystematicallychangeaminoacidsinenzymes,inordertobetterunderstandthefunctionoftheseimportantbiocatalysts.Theresearcherscanalsoanalysehowaproteinisfoldedintoitsbiologicallyactivethree-dimensionalstructure.Themethodcanalsobeusedtostudythecomplexcellularregulationofthegenesandtoincreaseourunderstandingofthemechanismbehindgeneticandinfectiousdiseases,includingcancer.第38頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

第39頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1.影響的各種因素一.寡核苷酸介導的位點特異性突變1）DNA模板的制備2）引物的設計和選擇引物的特性引物的設計3）突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件4）關于DNA聚合酶的選擇5）受體細胞對突變體產(chǎn)率的影響第40頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.幾種寡核苷酸介導的基因突變方法Kunkel突變法第41頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1)將待突變的基因克隆到質(zhì)粒中，導入具有ung-dut-

雙缺陷的E.coli

中.dut-(缺少dUTPase，導致細胞內(nèi)dUTP水平上升)細菌聚集dUTP，并在DNA復制時，部分取代dTTP進入DNA新生鏈。ung-(缺少尿嘧啶脫糖苷酶)細菌不能去除摻入的dUTP，最終的結(jié)果是，轉(zhuǎn)入到細菌中的質(zhì)粒DNA中，大約由1％的T被U所取代。第42頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Figure1.

dsDNAplasmidistransformedintoung-bacteriawhichconvertstheT's

toU's.Inthisexample,theGCbasepairwillbetargetedformutagenesis.

ThisU-containingplasmidisconvertedtosingle-strandedDNA.第43頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2)含有U的目標DNA與含有突變的寡核甘酸片斷孵育，該寡核甘酸片斷除了需要的突變點外，都與目標DNA配對。這種突變可以是一個或幾個核甘酸的插入、刪除和堿基替換。然后該混合物與Klenow,dNTP‘s孵育，接著加入連接酶和ATP產(chǎn)生雙鏈的質(zhì)粒，其中一條鏈含有U，而新合成的鏈只含有T。需要注意的是突變的核甘酸與舊的模板鏈是不配對的。第44頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Figure2.Targetplasmidisusedasatemplatetoproduceasecondstrand

ofDNAthatcontainsthedesiredmutationandonlyT's第45頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3)最后，雜交的雙鏈DNA被轉(zhuǎn)入到正常的細菌中，其尿嘧啶－糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原來的模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。再以此突變鏈為模板合成出來的新鏈都含有突變堿基。最終所有的質(zhì)粒都含有新的突變堿基。第46頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Figure3.

Hybridplasmidistransformedintowild-typebacteriathatconverttheoriginalU-containingstrandofDNAintoastrandofT-containingDNAthatiscomplementofthemutatedsequence(ingreen).TheoriginalGC

basepairhasbeenconvertedtoanewTAbasepair.第47頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四抗生素抗性回復突變法此體系利用pALTER-1噬菌粒為突變載體。Thesystemsuseantibioticselectionasameanstoobtainahighfrequencyofmutants.

特點：1.有MCS2.含Amps,Tetr3.利用Helperphage第48頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

?previousPromegaCorporation~2800WoodsHollowRoad~Madison,WIUSA

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printfigure0578va第49頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四pALTER?-1載體含氨芐青霉素和四環(huán)素兩個抗性基因,但是氨芐青霉素的抗性基因是沒有活性的。氨芐修復寡核甘酸可以在突變反應中恢復突變鏈的氨芐的抗性。ThepALTER?-1Vectorcontainsgenesforampicillinandtetracyclineresistance,buttheampicillinresistancegenehasbeeninactivated.TheAmpicillinRepairOligonucleotiderestoresampicillinresistancetothemutantstrandduringthemutagenesisreaction.

第50頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第52頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第53頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第54頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四適合的寡核甘酸片斷可以同時用在突變反應中，去除一個抗生素活性的同時而修復另一種抗生素活性。用這種方法隨后的突變和選擇可以在同一質(zhì)粒上進行，而不需要亞克隆。Theappropriateoligonucleotidescanbeusedsimultaneouslyinthemutagenesisreactiontoinactivateoneresistancegenewhilerepairingtheother.Inthisway,subsequentroundsofmutagenesisandselectioncanbeperformedonthesameplasmidwithoutsubcloning.

第55頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四特點：多克隆位點，用以對目標基因的克隆。含有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素(Amps)的抗性基因,在突變中用氨芐青霉素抗性修復寡核甘酸使AmpsAmpr,用于對陽性克隆的篩選。利用輔助噬菌體超感染，制備含目標基因的單鏈DNA作為突變模板DNA。為提高突變效率，受體菌應是點錯配修復缺失的菌株。第56頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四基于去除特定限制酶切位點的突變法在突變載體DNA上除了有克隆外源基因的克隆位點外，還有一獨特的限制酶切位點。第57頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四該該位點也不存在目標基因上第58頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四突變時用兩個引物：一是突變引物；二是獨特限制酶切位點去除的選擇性引物。第59頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點：不需制備單鏈DNA;不需輔助噬菌體；不需進行亞克隆。第60頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點：方便、快捷、不受限制性內(nèi)切酶識別位點的限制二.利用PCR產(chǎn)生定點突變

利用PCR法在基因5’末端區(qū)或

3’末端區(qū)產(chǎn)生突變2.重疊延伸(overlapextension)和基因突變

第61頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四5Add-onmutagenesis

Thisisacommonlyusedpracticeinwhichanewsequenceorchemicalgroupisaddedtothe5’endofaPCRproductbydesigningprimerswhichhavethedesiredspecificsequenceforthe3’partoftheprimerwhilethe5’partoftheprimercontainsthenovelsequenceorasequencewithanattachedchemicalgroup.Theextra5’sequencedoesnotparticipateinthefirstannealingstepofthePCRreaction(onlythe3’partoftheprimerisspecificforthetargetsequence),butitsubsequentlybecomesincorporatedintotheamplifiedproduct,therebygeneratingarecombinantproduct,第62頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四(A)5

add-onmutagenesis.Primerscanbemodifiedatthe5endtointroduce第63頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四加到PCR引物5‘端的序列摻入到PCR產(chǎn)物的末端。一個PCR擴增片段可與另一個PCR擴增片段上的序列相重疊，其后的反應中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此產(chǎn)生一個新的重組分子。非生產(chǎn)鏈生產(chǎn)鏈第64頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四取代突變第65頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四缺失突變第66頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四插入突變第67頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第68頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四幾點補充：重疊延伸反應中非生產(chǎn)鏈的命運？重疊延伸反應進行基因剪接，其不同部位在反應中執(zhí)行不同功能引導區(qū)(primingregion):寡核苷酸3’端重疊區(qū)(overlapregion):寡核苷酸5’端插入?yún)^(qū)：重疊區(qū)和引導區(qū)之間第69頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四盒式突變（cassettemutagenesis),

又稱片段取代法（DNAfragmentreplacement)關鍵1.目標基因序列中有適當限制酶切位點

2.如何得到各種合適的用以取代目標基因中特定DNA片段的突變DNA片段三.區(qū)域性定向突變第70頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四四.隨機突變（randommutagenesis)當缺乏目的基因序列的詳盡資料時，定點突變就受到限制，此時可利用隨機突變。第71頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第72頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四待突變基因克隆到載體上，其下游緊接兩個限制酶切位點。前一酶切位點是5‘突出，后一酶切位點是3’突出第73頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四ExoIII催化線性雙鏈DNA或有缺口環(huán)狀DNA自3‘-OH端逐一釋放5’單核甘酸。適當時機終止酶切反應缺口填補，類似物摻入DNA鏈的一處或多處第74頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四S1核酸酶處理單鏈末端，形成平末端50％基因攜帶有錯配的堿基，導致位點變異第75頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達第76頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第77頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四一.目標蛋白在E.coli中的表達在E.coli

中表達蛋白是非常簡單,快速和便宜的。有很多商品化和非商品化的載體，在N-末端或C-末端有標簽（tag),并有很多菌株供使用者選擇。TheexpressionofproteinsinE.coliistheeasiest,quickestandcheapestmethod.Therearemanycommercialandnon-commercialexpressionvectorsavailablewithdifferentN-andC-terminaltagsandmanydifferentstrainswhichareoptimizedforspecialapplications.第78頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點

1.遺傳學和生理學背景清楚

2.容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵

3.外源基因?？梢愿咝П磉_第79頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四不足

1.不能進行典型真核細胞所具有的復雜的翻譯后修飾

2.限制二硫鍵的形成，多亞基復合體的組裝

3.外源基因易形成不溶性的包涵體第80頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

表達載體（expressingvector)

用來在宿主細胞中表達外源基因的載體，除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。

原核細胞表達載體，E.coli真核細胞表達載體，yeast,mammaliancell第81頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四RecombinantproteinscanbeproducedinE.colicellsusingspecificexpressionvectors.BasicelementsformakinganE.coli

expressionvector第82頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四

表達載體的一般特點

復制起始點選擇性基因強的，可誘導的啟動子強的轉(zhuǎn)錄終止序列核糖體結(jié)合位點合適的多克隆位點第83頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.與外源基因有效表達的相關因素1）有效的轉(zhuǎn)錄起始2）有效地翻譯3）蛋白質(zhì)水解作用4）蛋白質(zhì)的外泌第84頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3.蛋白質(zhì)表達的方法Atypicalexpressionexperimentconsistsofthefollowingstep:Pickingofasinglecolonyfromafreshlystreakedplateoftheexpressionhostcontainingtherecombinantvector.Growingofastarterculture.Inoculate(接種)withthepickedcolonyupto50mlofrichmedium(suchasLBor2xYT)containingtheappropriateantibiotic.Whenalargerstartercultureisrequired,inoculate4mlofrichmediawiththesinglecolony;growfor4-8hoursat37°C;andusethistoinoculatethestarterculture.第85頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四InoculationofthemaincultureandincubationuntilOD600reaches0.4-1.TheoptimalODvaluedependsontheculturemethodandthemedium.ForflaskculturesusingLB-mediumanOD600

of

0.6isrecommended.Toincreasethegrowthrate,wecarryouttheculturesat37°CuntiltheODforinductionisreached.Thentheculturesarecooledtotheinductiontemperatureinice-water.Inductionofproteinexpression.Proteinexpressionisinducedbytheadditionoftheproperinducerorbychangingthegrowthconditions.Fromthispointonthecellswillusemostoftheirresourcesfortheproductionofthetargetproteinandwillnotgrowmuchfurther.第86頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Forthemostusedpromotersinductionconditionsarelistedbelow.Promoter

induction

typicalcondition

rangetrc(hybrid)additionofIPTG0.2mM0.05-2.0mMaraBADadditionofl-arabinose0.2%0.002-0.4%PL

liftingthetemperaturefrom37to42CT7-lacoperatoradditionofIPTG0.2mM0.05-2.0mM

第87頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Afterinductiontheculturesareincubatedfrom3hourstoovernightdependingontheinductiontemperature.Incubationtemperatureincubationtime15°Covernight20°Covernight25°Covernight30°C5-6h37°C3-4hHarvestingofthecellpelletbycentrifugation(20minat6000g).Cellpelletsarestoredat-20°C.第88頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四4.改善表達水平及溶解性的方法1）如何改善表達水平

誘導條件外源基因的編碼序列用蛋白酶缺失的宿主菌

第89頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2）如何改善外源蛋白的溶解性

Inmanycasestheexpressedproteinisinsolubleandaccumulatesinso-calledinclusionbodies(包含體).Thisisespeciallytrueunderconditionsofhighlevelexpression.Severalstrategiesareavailabletoimprovethesolubilityoftheexpressedprotein.第90頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1.Reducingtherateofproteinsynthesis.

Thiscanbedoneby:loweringthegrowthtemperature.Thisdecreasestherateofproteinsynthesisandusuallymoresolubleproteinisobtained.usingaweakerpromoter(e.g.

trcinsteadofT7).usingalowercopynumberplasmid.loweringtheinducerconcentration.第91頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.Changingthegrowthmedium.

additionofprostethicgroupsorco-factorswhichareessentialforproperfoldingorforproteinstability.additionofbuffertocontrolpHfluctuationinthemediumduringgrowth.additionof1%glucosetorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).additionofpolyols(e.g.sorbitol)andsucrose.Theincreaseinosmoticpressure(滲透壓)causedbytheseadditionsleadstotheaccumulationofosmoprotectantsinthecell,whichstabilizethenativeproteinstructure.additionofethanol,lowmolecularweightthiolsanddisulfides,andNaCl.第92頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3.Co-expressionofchaperonesand/orfoldases.Twoclassesofproteinsplayanimportantroleininvivoproteinfolding.Molecularchaperonespromotetheproperisomerizationandcellulartargetingbytransientlyinteractingwithfoldingintermediates.ThebestcharacterizedE.colisystemsare:GroES-GroEL

DnaK-DnaJ-GrpE

ClpB

第93頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四GroEL/GroES復合物GroESGroEL第94頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第95頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四第96頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Foldasesacceleraterate-limitingstepsalongthefoldingpathway.Threetypesoffoldasesplayanimportantrole:peptidylprolylcis/transisomerases(PPI's肽基脯氨酰異構酶)disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC)proteindisulfideisomerase(PDI)-aneukaryoticproteinthatcatalyzesbothproteincysteineoxidationanddisulfidebondisomerization.Italsoexhibitschaperoneactivity.第97頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Co-expressionofoneormoreoftheseproteinswiththetargetproteincouldleadtohigherlevelsofsolubleprotein.Thelevelsofco-expressionofthedifferentchaperones/foldaseshavetobeoptimizedforeachindividualcase.DsbAandDsbChavealsoshownpossitiveeffectsonexpressionlevelswhenusedasafusionpartner.第98頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四4.Periplasmicexpression.

Secretionofthetargetproteintotheperiplasmhasanumberofdistinctadvantages:theoxidizingenvironmentoftheperiplasmallowsfortheformationofdisulfidebonds,whichdoesnotoccurinthereducingenvironmentofthecytoplasm.theperiplasmcontainstwofoldases,disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC),thatcatalyzetheformationandisomerizationofdisulfidebonds.reducedproteolysis(sincelessproteinsarepresent).allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.engineeringofanauthentic(可信的)N-terminus.第99頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Secretionisachievedbytheadditionofaleadersequence(signalpeptide)totheN-terminusofthetargetprotein.MostusedleadersequencesarepelBandompT.Unfortunately,expressionyieldareusuallymuchlowerandnotallexpressedproteinissecretedintotheperiplasmbutisalsofoundinthemedium,thecytoplasmandthecytoplasmicmembrane.第100頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四5.Usingspecifichoststrains.Thesolubilityofdisulfidebondcontainingproteincanbeincreasedbyusingahoststrainwithamoreoxidizingcytoplasmicenvironment.Twostrainsarecommerciallyavailable(Novagen):AD494,whichhasamutationinthioredoxinreductase(trxB).Origami,adoublemutantinthioredoxinreductase(trxB)andglutathionereductase(gor).第101頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四6.Additionofafusionpartner.FusionoftheN-terminusofaheterologousproteintotheC-terminusofasolublefusionpartneroftenimprovesthesolubilityofthefusionprotein.7.Expressionofafragmentoftheprotein.

E.colidoesnotexpresswellverylargeproteins(>70kDa).Choosingasmallerfragmentofthetargetproteincanimproveexpressionlevelsandsolubility.Thesolubilityofapoorlysoluble(orinsoluble)proteincanalsobeimprovedbyselectingonlyasolubledomainforexpression.第102頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四8.Invitrodenaturationandrefoldingoftheprotein.Whendespitealleffortsthetargetproteinstillisexpressedininclusionbodies,thenthelastresortistodenatureandrefoldtheproteininvitro.Thisprocedureiscarriedoutinthreephases:isolationoftheinclusionbodies.solubilizationanddenaturationofthetargetprotein.Thisisdonebytheadditionofadenaturingagent(usuallyguanidineorurea)underreducingconditions(e.g.20mMDTT).refoldingoftheproteinbyremovingthedenaturatingagentusingdialysis,dilutionorchromatography.Forproteinscontainingdisulfidebondsthishastobecarriedoutinthepresenceofaredoxshuttlingsysteme.g.reducedandoxidizedglutathione.第103頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3)如何改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性Ingeneralproperlyfoldedproteinarequitestable.Theprecisestructuralfeaturesthatimpartstabilitytoproteinsarenotknown.Nonetheless,somedeterminantsofproteininstabilityhavebeenelucidated.第104頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1.N-endrule.InE.coliN-terminalArg,Lys,Leu,Phe,Tyr,andTrpresiduesgreatlydecreasethehalf-lifeoftheprotein.AtestproteinwiththeseresiduesintheN-terminalpositionshowedhalf-lifesofonly2minutescomparedtomorethan10hourswithallotheraminoacids(exceptproline).

Reference:Tobiasetal.(1991)Science254,1374-1377.2.PESThypothesis.IneukaryotesproteinsaredestabilizedbyregionsenrichedinPro,Glu,Ser,andThr.

第105頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四Sometimesthelevelsofproteinexpressionarelowbecauseofhighlevelofproteaolyticdegradationofthetargetprotein.Thefollowingapproachescanbeusedtoimporvetheexpressionlevel:i.Usingprotease-deficienthoststrains.Theuseofhoststrainscarryingmutationswhicheliminatetheproductionofproteasescansometimesenhanceaccumulationbyreducingproteolyticdegradation.BL21,theworkhorseofE.coliexpression,isdeficientintwoproteasesencodedbythelon(cytoplasmic)andompT(periplasmic)genes.第106頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四ii.Periplasmicexpression.Intheperiplasmproteolyticdegradartionofproteinsisdecreased.Thisismainlybecausethetotalnumberofproteinsintheperiplasmislower.iii.Decreasingthegrowthtemperature.Reducingthegrowthtemperaturewillresultinslowerproteinproductionbutalsoinslowerproteolyticdegradation.Theoverallresultisoftenanincreasedexpressionlevelofthetargetprotein.第107頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四4）如何減少蛋白質(zhì)的毒性Lowexpressionlevelsornoexpressionatallcanalsobecausedbytoxicityofthetargetprotein.Proteintoxicitycanmanifestitselfondifferentlevels:第108頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四1.Incompleterepressionofproteinexpression.Manypromotersarenotverytightlyregulatedandshowsomedegreeofexpressionbeforetheadditionoftheinducer.Especiallylacpromotersareleaky.Oftenthisleakinessleadstoplasmidinstabilityand/orlossofplasmid.Asaconsequencetheculturewillbeovergrowbycellsthathavelosttheplasmid(especiallywhenampicillinisusedasaselectablemarker)orwillnotgrowatall.

Differentapproachescanbeusedtogiveamoretightlyregulatedexpression:第109頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四constitutiveexpressionofarepressorprotein.InthecaseofthelacpromoterbytheexpressionofthelacrepressorfromthelacIorlacIqgene.FormediumcopynumberplasmidsitissufficienttouseahoststraincarryingthelacIqallele(等位基因).Highercopynumberplasmidsshouldcontaintherepressorgeneonthevector.useamoretightlyregulatedpromoter,e.g.thearabinosepromoter(PBAD).usealowercopynumberplasmid.

第110頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四constitutiveexpressionofphageT7lysosymefromacompatiblepLysSorpLysEplasmid(Novagen).LysosymebindstoT7RNApolymeraseandinactivatestheenzyme.AftertheadditionofIPTGtheexpressionlevelofthepolymerasewillbemuchhigherthanthatoflysosymeandthiswillovercometherepression.additionof1%glucosetotheculturemediumtorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).第111頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四2.Besidestighteningregulation,otherapproachesexisttopreventlosingtheexpressionvectorfromthecells.useofelevatedlevelsofantibiotics(upto200mg/ml).usethe"plating"methodforinoculatingcultures.Culturesareinoculatedbyscrapingoffagarplates第112頁，共132頁，2023年，2月20日，星期四3.Toxicityuponinduction.Someproteinsaresotoxicforthecellsthattheydonotonlyinhibitgrowthbutalsokillthem.Thus,almostimmediatelyafterinductioncellsdieandexpressionlevelswillbeverylow.Severalapproachesarepossibletodecreasetheeffectsofproteintoxicity:periplasmicexpression.Secretionofthetargetproteintotheperiplasm(orthemedium)allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.