(4.9)-第八章生物酶工程

AdvancedEnzymeEngineering第八章生物酶工程酶學和以基因重組技術為主的現(xiàn)代分子生物學技術相結(jié)合的產(chǎn)物亦稱高級酶工程（AdvancedEnzymeEngineering）生物酶工程合成酶雜合體（融合酶）用基因工程技術大量生產(chǎn)酶（克隆酶）酶分子的改造（突變酶/定向進化酶）抗體酶核酶ContentsGoGoGoGoGo第一節(jié)酶基因的克隆和表達克隆酶的制備：酶基因的克隆酶的異源表達發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化已學習一、酶基因的克隆定義：在體外將各種來源的目的酶基因與載體連接形成具有自我復制能力的DNA分子（即重組載體），然后通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方式將重組載體導入宿主細胞并培養(yǎng)，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取，從而獲得大量所需酶基因。目的：獲得大量目的酶基因一、酶基因的克隆酶基因克隆的主要操作步驟目的基因的獲取克隆載體的選擇目的酶基因與載體連接（構(gòu)建重組載體）重組載體導入受體細胞重組子的篩選與鑒定一、酶基因的克隆1.目的基因的獲?、貾CR——序列已知，設計引物②基因組DNA文庫——先構(gòu)建，再篩選③cDNA文庫——先構(gòu)建，再篩選（RT-PCR）④人工化學合成——序列已知、片段較短，直接合成目的DNA一、酶基因的克隆2.克隆載體的選擇

基因克隆載體：可攜帶外源基因并將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的DNA分子

理想克隆載體的要求：①獨立復制子，有復制起始位點，可在宿主細胞中獨立自主復制②有若干合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點，便于外源DNA的插入③有易被識別篩選的標志基因④安全，不含對受體細胞有害的基因一、酶基因的克隆3.目的酶基因與載體連接黏性末端連接：T4或E.coliDNA連接酶平端連接：T4DNA連接酶黏性末端-平端連接：

先在DNA片段末端加入人工接頭，再進行連接一、酶基因的克隆4.重組載體導入受體細胞導入原核受體細胞（細菌）：制備感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子氯化鈣法：Ca2+電穿孔法：高壓電脈沖轉(zhuǎn)導：λ-噬菌體顆粒一、酶基因的克隆一、酶基因的克隆一、酶基因的克隆4.重組載體導入受體細胞導入真核受體細胞：酵母細胞：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法動物細胞：電穿孔法、微量注射法、磷酸鈣共沉淀法植物細胞：Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、微量注射法一、酶基因的克隆5.重組子的篩選與鑒定①載體選擇標記法：初步篩選如抗生素抗性、營養(yǎng)缺陷性、藍白斑篩選等②PCR法③核酸雜交法：標記核酸做探針④免疫學方法——放射性免疫法和酶聯(lián)免疫法⑤DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析法⑥核苷酸序列測定法一、酶基因的克隆第一節(jié)酶基因的克隆和表達二、酶的異源表達

原核基因——原核細胞真核基因——真核細胞/原核細胞表達系統(tǒng)：原核/真核生物基因表達體系

表達過程：DNA轉(zhuǎn)錄為mRNAmRNA翻譯為蛋白質(zhì)二、酶的異源表達1.外源基因在原核細胞中的表達原核生物基因表達體系優(yōu)點：

宿主菌遺傳背景清楚，種類豐富，使用方便操作簡便，繁殖快，周期短大規(guī)模生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高下游純化工藝簡單，生產(chǎn)效率高1.外源基因在原核細胞中的表達大腸桿菌基因表達載體：DNA復制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)二、酶的異源表達2.外源基因在真核細胞中的表達二、酶的異源表達第二節(jié)酶分子的改造遺傳修飾改變酶的性能：（1）提高酶的活性（2）提高酶的穩(wěn)定性（3）改變底物專一性（4）改變酶的最適pH值（5）改變酶對輔酶的要求（6）改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)能力酶分子改造的主要方法：

酶的定點突變

酶分子定向進化第二節(jié)酶分子的改造一、酶的定點突變

1.定義：在酶基因的特定位點引入突變，即通過取代、插入或刪除已知DNA序列中特定的核苷酸序列來改變酶蛋白結(jié)構(gòu)中某個或某些特定的氨基酸，從而改變酶的性質(zhì)。酶分子的理性設計：利用定點突變技術有目的地在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷特點：突變率高、重復性好、簡單易行2.酶定點突變的方法寡核苷酸定點突變：用含有突變堿基的寡核苷酸片段做引物，在體外以原基因序列為模板進行復制基于PCR的定點突變：重組PCR法、重疊延伸突變、大引物定點突變法盒式突變：利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應序列。一、酶的定點突變

二、酶分子定向進化1.定義：模擬天然酶的自然進化機制，在體外對酶基因進行改造，產(chǎn)生基因多樣性，再通過定向篩選（選擇）獲取具有特定性質(zhì)的突變酶的過程或技術。酶分子的非理性設計：人為模擬自然進化機制，利用隨機突變和定向篩選技術，獲得具有某些預期特征的進化酶。2018年諾貝爾化學獎一半授予美國科學家FrancesH.Arnold，表彰她對酶開展的定向進化研究FrancesH.Arnold1.在酶的DNA編碼中隨機引入突變；2.將突變的DNA編碼插入細菌里，讓細菌生產(chǎn)帶有不同突變的酶；3.人為設定一個篩選標準，保留滿足設定標準的酶突變體，淘汰不滿足標準的酶突變體；4.對保留下來的酶突變體再進行下一輪的隨機突變，如此反復循環(huán)，找到最適應篩選標準的酶突變體。Arnold改造的第一個酶

——枯草桿菌蛋白酶這種酶能夠切割降解其他蛋白質(zhì)，但它只在水溶液中發(fā)揮功能，在有機試劑中活力極低1993年，經(jīng)過三輪“隨機突變-篩選”循環(huán)，Arnold找到一個突變體，在化工產(chǎn)業(yè)常用的有機溶劑（DMF）里的活力比它初始的模版提升了256倍。這個突變體包含了10多個位點的突變，其中很多并不是酶的催化活性位點或者底物結(jié)合“口袋”，用傳統(tǒng)的學院派策略恐怕很難找到這種排列組合。這是酶定向進化第一次展示它的力量。2013年過世的荷蘭科學家WillemP.C.Stemmer建立的DNA體外同源重組技術（DNAshuffling）對定向進化的效率提高也有重大貢獻。二、酶分子定向進化二、酶分子定向進化二、酶分子定向進化2.酶分子定向進化的方法①通過隨機突變和體外重組創(chuàng)造基因多樣性；②導入適當載體構(gòu)建突變文庫；③通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。隨機突變：易錯PCR、定點飽和突變等基因重組：DNA改組、外顯子改組等

篩選策略底物顯色反應改變培養(yǎng)條件利用蛋白固有性質(zhì)高通量篩選二、酶分子定向進化討論：定向進化與定點突變在突變位點、突變效應、突變方法等方面的異同之處？定向進化：突變+篩選

突變位點隨機；突變位點的數(shù)目不確定；突變效應不可預知；凡能引起突變的因素（物理/化學/生物）都可應用于突變體的產(chǎn)生。定點突變：突變位點確定，突變位點個數(shù)可預知；突變效應可能已知，也可能未知；突變方法一般以PCR技術為基礎。第三節(jié)融合酶融合酶：將兩個或多個酶分子組合在一起所形成的融合蛋白融合酶的生產(chǎn)途徑①非理性設計：先構(gòu)建庫，再篩選所需融合體②理性設計：在了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的基礎上，有針對性地進行蛋白質(zhì)之間的交換和融合融合酶的構(gòu)建策略二級結(jié)構(gòu)融合功能域融合整個酶蛋白的融合融合酶的應用（略）第三節(jié)融合酶四、抗體酶（abzyme）P123抗體酶的發(fā)現(xiàn)1984年，Lerner和Schultz分別領導各自的研究小組獨立地證明了：針對羧酸酯水解的過渡態(tài)類似物產(chǎn)生的抗體，能催化相應的羧酸酯和碳酸酯的水解反應。1986年，Science同時發(fā)表了他們的發(fā)現(xiàn)，并將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為抗體酶或催化抗體。1.抗體酶的概念與特點抗體酶/催化抗體（abzyme/catalyticantibody）利用酶反應中底物過渡態(tài)類似物作為半抗原刺激免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的具有識別和催化相應底物能力的單克隆抗體，本質(zhì)上是一類具有催化活性的免疫球蛋白。

思路：以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導與其互

補構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性。

方法：化學修飾法/穩(wěn)定過渡態(tài)法/蛋白質(zhì)工程法/抗體庫法2.抗體酶的制備方法3.抗體酶的應用抗體介導前藥治療(antibody-directedenzymeprodrugtherapy,

ADEPT)：

①體內(nèi)注射能與腫瘤組織特異性結(jié)合的抗體酶②當其結(jié)合到靶部位后，再注入前藥③當藥物擴散至腫瘤細胞表面或附近時，抗體酶可快速將其水解并釋放出抗腫瘤藥物，從而提高局部藥物濃度，實現(xiàn)靶向治療。4.抗體酶的發(fā)展前景待解決問題催化效率抗體酶篩選抗體酶專一性底物抑制催化基團的最適裝配五、核酶（ribozyme）(一)核酶的發(fā)現(xiàn)(一)核酶的發(fā)現(xiàn)上世紀80年代初期，美國科羅拉多大學博爾德分校的ThomasCech和美國耶魯大學的SidneryAltman各自獨立地發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，從而改變了生物催化劑的傳統(tǒng)概念。T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學獎。T.Cech的研究工作S.Altman的研究工作S.Altman的研究工作啟示：T.Cech為什么能發(fā)現(xiàn)RNA的催化作用并獲得諾貝爾獎？如果你是一個不為常識所束縛的人，那么，你有可能獲諾貝爾獎S.Altman為什么能發(fā)現(xiàn)RNA的催化作用并獲得諾貝爾獎？如果你能根據(jù)別人剛剛發(fā)表的成果馬上修正自己的研究工作，那么，你有可能獲諾貝爾獎。認真做實驗認真看文獻1.核酶：具有生物催化功能的RNA。生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶

enzyme

極端酶extremozyme

抗體酶abzyme

生物工程酶其它：模擬酶modelenzyme

核酸類:核酶ribozyme脫氧核酶deoxyribozyme（二）核酶的概念和分類內(nèi)切核酸酶+連接酶

Ⅰ型內(nèi)含子四膜蟲rRNA剪接型核酶Ⅱ型內(nèi)含子某些真核生物的線粒體

和葉綠體rRNA

Ⅲ型內(nèi)含子pre-mRNA

2.核酶的分類2.核酶的分類

錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒（HDV）核酶RNaseP

RNA切割（三）核酶在醫(yī)藥領域的應用1.核酶治療疾病的原理2.核酶的給藥途徑外源性給藥：直接將抗核酸酶降解的核酸注射到組織或細胞內(nèi)。內(nèi)源性給藥：利用基因療法，借助逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒運送核酶2.

核酶的給藥途徑3.核酶在醫(yī)學上的應用Flexizyme——PeptiDream多肽文庫建立：能夠?qū)?00多種不同的氨基酸與tRNA任意組合，合成幾乎任何想要