微生物工程第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設(shè)計

微生物工程第三章發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設(shè)計第1頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基：指用于維持供微生物生長繁殖和產(chǎn)物形成所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進(jìn)產(chǎn)物的形成第2頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四單位培養(yǎng)基能產(chǎn)生最大量的目的產(chǎn)物；能夠使目的產(chǎn)物合成速率最大；能夠使副產(chǎn)物合成的量最少；所采用的培養(yǎng)基應(yīng)該質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉、易于長期獲得；盡量不影響工業(yè)好氣發(fā)酵中的通氣攪拌性能以及發(fā)酵產(chǎn)物的后處理。工業(yè)發(fā)酵微生物培養(yǎng)基的共性：第3頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的成分及來源微生物的培養(yǎng)基類型發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計原理與優(yōu)化方法本章內(nèi)容：第4頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求工業(yè)培養(yǎng)基：

指提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。第5頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分；提高單位營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率；提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力；提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期；減少副產(chǎn)物和“三廢”物質(zhì)，便于分離純化；原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易；減少對發(fā)酵通氣攪拌的影響，降低能耗。工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)基的設(shè)計要求：重點第6頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源一、碳源1、作用①提供微生物菌種生長繁殖所需的能源及合成菌體所必需的碳骨架；②提供菌體合成目的產(chǎn)物的原料。2、來源糖類、油脂、有機(jī)酸、正烷烴、低碳醇等第7頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖會引起葡萄糖效應(yīng)過量加速菌體呼吸，導(dǎo)致溶解氧不能滿足需要

工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)第8頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大第9頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四②糖蜜

糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達(dá)50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。第10頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四不同加工方法對甘蔗糖蜜的影響：第12頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四糖蜜使用應(yīng)注意除雜：

除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）預(yù)處理：→黃血鹽（亞鐵氰化鉀：作為除鐵劑）第13頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四③

淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格低廉，可以解除葡萄糖效應(yīng)第14頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四例：地衣芽孢桿菌生產(chǎn)α-淀粉酶碳源對生長和產(chǎn)酶的影響：碳源細(xì)胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第15頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四李江華，無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2004(1.5g麩皮)第16頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響結(jié)果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學(xué)與工業(yè)，2004第17頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四４、油和脂肪油、脂肪甘油＋脂肪酸CO2＋H2OATP脂肪酶氧氣※供氧要充足，否則會使有機(jī)酸積累，引起pH下降常用：豆油、菜油、葵花籽油、豬油、魚油、棉籽油等第18頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵過程中會使pH上升CH3COONa＋O2→CO2+H2O+NaOH常用：乳酸、檸檬酸、乙酸５、有機(jī)酸及其鹽第19頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四正烷烴（C14～18)、乙醇、甲醇等菌體收、得率較高６、烴和醇類第20頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四二、氮源氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。

1、無機(jī)氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：吸收利用快（速效氮源），常引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH第21頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四生理酸性物質(zhì)——經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源（如硫酸胺）；生理酸性物質(zhì)——經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成堿性物質(zhì)的無機(jī)氮源（如硝酸鈉）；所以選擇合適的無機(jī)氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用！第22頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究：陳濤，中國釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大初始pH對毛霉產(chǎn)蛋白酶活的影響第23頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四無機(jī)氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>脲毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究：陳濤，中國釀造，2004第24頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四2、有機(jī)氮源來源：廉價原料（花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟等）。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無機(jī)鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）②較多的乳酸、苯乙酸③硫、磷、微量元素等第25頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

有機(jī)氮源成分復(fù)雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進(jìn)行影響，而另一方面有機(jī)氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機(jī)氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響。第26頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四氮源使用的一些相關(guān)問題：

有機(jī)氮源和無機(jī)氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機(jī)氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機(jī)氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機(jī)氮源仍然是研究重點第27頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四三、無機(jī)鹽及微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補(bǔ)充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定4、使用時應(yīng)注意：對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機(jī)離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮。例：青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進(jìn)行表面處理第28頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四B.使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，pH對酶活的影響：

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘第29頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四四、水對于發(fā)酵工廠，潔凈、恒定的水源至關(guān)重要。水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)：pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻。對于常規(guī)發(fā)酵，也需要可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。

第30頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四五、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

1、生長因子

有機(jī)氮源是這些生長因子的重要來源第31頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四概念：指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大提高的一類化合物。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第32頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：按分子量衡算（考慮轉(zhuǎn)化率）例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸？青霉素=6000*0.6（微克）=36mg/ml

苯乙酸=（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉(zhuǎn)化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉(zhuǎn)化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第33頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四用法：前體使用時普遍采用流加的方法

前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利

例：苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

流加也有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化；

第34頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。3、產(chǎn)物促進(jìn)劑第35頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的可能機(jī)制：本身是酶的誘導(dǎo)物；是表面活性劑；對酶的表面失活有保護(hù)作用；是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第36頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)微生物的培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基可按其組成物質(zhì)的純度、狀態(tài)、用途分類一、按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來源豐富、價格低廉、適于工業(yè)生產(chǎn)

原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

第37頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四M培養(yǎng)基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10g,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨（日本大五營養(yǎng)）10g，酵母提取物（英國Oxoid）5g,NaCl10g，pH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基第38頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)。半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。第39頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四斜面培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基三、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）可分為：第40頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四要求：能使菌體生長快，產(chǎn)生孢子數(shù)量大、質(zhì)量好，且不會引起菌種變異。對放線菌或霉菌產(chǎn)孢子培養(yǎng)基：C、N源不宜多，否則只長菌絲，少長或不長孢子；無機(jī)鹽濃度要適當(dāng)控制，否則會影響孢子的顏色和孢子量。1.斜面培養(yǎng)基第41頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四要求營養(yǎng)豐富、完全，氮和維生素的含量高些；培養(yǎng)基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子萌發(fā)生長；pH要穩(wěn)定；最后一級盡可能接近發(fā)酵培養(yǎng)基，常加入少量發(fā)酵合成期才大量需要的物質(zhì)。2.種子培養(yǎng)基第42頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四目的：獲得高產(chǎn)量的發(fā)酵產(chǎn)物。要求：營養(yǎng)豐富完全，有利于產(chǎn)物合成；不能大量加入快C、N源，應(yīng)和慢C、N源相結(jié)合；在產(chǎn)物分泌期間，pH穩(wěn)定；加入適量合成所需的前體等物質(zhì)，定向發(fā)酵；采用中間補(bǔ)料，以提高發(fā)酵單位；原料的考慮——成本問題。3.發(fā)酵培養(yǎng)基第43頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計原理與優(yōu)化方法培養(yǎng)基設(shè)計的重要性：對現(xiàn)存發(fā)酵培養(yǎng)基引用吸收的必要驗證；對菌種發(fā)酵條件認(rèn)識的必需途徑；發(fā)酵技術(shù)建立的一個重要步驟；發(fā)酵生產(chǎn)成本控制的重要渠道。第44頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四一、發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計原理

確定培養(yǎng)基的組成成分確定各組分之間的最佳配比設(shè)計目的：第45頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

第46頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基組分及濃度選擇需考慮的因素：菌體的同化能力代謝的阻遏和誘導(dǎo)合適的C、N比（100∶0.2～2.0）pH的要求重點第47頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四二、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

培養(yǎng)基設(shè)計與優(yōu)化一般過程：根據(jù)以前經(jīng)驗，初步確定可能的培養(yǎng)基組分單因子優(yōu)化實驗確定最為適宜的各組分及最適濃度多因子實驗進(jìn)一步優(yōu)化重點第48頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（1）理論轉(zhuǎn)化率與實際轉(zhuǎn)化率

理論轉(zhuǎn)化率：指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進(jìn)行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。

實際轉(zhuǎn)化率：指實際發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率的大小

如何使實際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化是發(fā)酵控制的一個重要目標(biāo)！第49頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四例:

如在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論轉(zhuǎn)化率計算如下∶葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的代謝總反應(yīng)衡算式為∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論得率為∶

2*46

Y=───=0.52176第50頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四（2）實驗設(shè)計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法

正交實驗設(shè)計多因子實驗：響應(yīng)面分析單因子實驗第52頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四方法結(jié)果培養(yǎng)基優(yōu)化的基本方法正交實驗均勻設(shè)計神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)其他方法聚類分析響應(yīng)面分析單因子實驗成本發(fā)酵單位第53頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健第54頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四原培養(yǎng)基:第55頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第56頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進(jìn)一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第57頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機(jī)鹽:復(fù)合無機(jī)鹽0.05%第58頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四

正交設(shè)計確定優(yōu)化的配方第59頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四第60頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四改進(jìn)后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進(jìn)后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果第61頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基配方：1、部分因子實驗（FFD）

初步篩選主要影響因子2、最陡爬坡實驗

確定主要影響因子最適取值范圍3、中心組合實驗（CCD）

確定最佳實驗點第62頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基第63頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設(shè)計的第一步

反應(yīng)器—最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方第64頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐：葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量

4-8%，補(bǔ)加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基差別很大第65頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)第66頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平,

可以得出最終優(yōu)化的基礎(chǔ)配方第67頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四pH控制搖床：反應(yīng)器水平上的搖瓶研究第68頁，共73頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基設(shè)計時注意的一些相關(guān)問題

原料及設(shè)備的預(yù)處理