質(zhì)粒DNA的提取及檢測課件

質(zhì)粒DNA的提取及檢測

質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。

常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等

質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1~n個(gè)）松弛型復(fù)制（20個(gè)以上）

常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18,pUC19(500~700提純的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA

質(zhì)粒的檢測——凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第一部分質(zhì)粒DNA的提取

二、實(shí)驗(yàn)原理

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品

實(shí)驗(yàn)器具

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器。實(shí)驗(yàn)材料含PUCm-T的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。

實(shí)驗(yàn)藥品1.LB培養(yǎng)基配制及分裝(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高壓滅菌

3.分離液酚/氯仿/異戊醇＝25:24:14.無水乙醇5.70%乙醇6.無菌水各試劑的作用：

溶液I作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管（可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴30min12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（振蕩混勻、離心）12000rpm，離心10min沉淀超凈臺(tái)中風(fēng)干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存第二部分瓊脂糖凝膠電泳核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度

0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb

5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。

影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓一般5V/cm、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理

DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在PH3.5時(shí)，整個(gè)分子帶正電；PH8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。