藥物分析-03藥物分析方法

藥物分析方法化學(xué)分析法容量分析法重量分析法儀器分析法色譜分析法光譜分析法電化學(xué)分析核磁、質(zhì)譜等技術(shù)第一頁(yè)，共59頁(yè)。一、常規(guī)的化學(xué)分析法1.容量（滴定）分析法

將一種標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到待測(cè)物質(zhì)的溶液中，直到與待測(cè)物質(zhì)按化學(xué)計(jì)量關(guān)系定量反應(yīng)為止，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和所消耗的體積，計(jì)算待測(cè)物質(zhì)含量的方法。第二頁(yè)，共59頁(yè)?；拘g(shù)語(yǔ)滴定：將滴定劑通過(guò)滴管滴入待測(cè)溶液中的過(guò)程。滴定劑（標(biāo)準(zhǔn)溶液）：濃度準(zhǔn)確已知的溶液。指示劑：滴定分析中能發(fā)生顏色改變而指示終點(diǎn)的試劑。滴定終點(diǎn)：滴定分析中指示劑發(fā)生顏色改變的那一點(diǎn)。第三頁(yè)，共59頁(yè)。2、滴定分析法的分類(lèi)A）按化學(xué)反應(yīng)類(lèi)型分類(lèi)酸堿滴定法：質(zhì)子轉(zhuǎn)移絡(luò)合滴定法：生成絡(luò)合物氧化還原滴定法：電子轉(zhuǎn)移沉淀滴定法：生成沉淀滴定操作第四頁(yè)，共59頁(yè)。2、滴定分析法的分類(lèi)B）按滴定方式分類(lèi)直接滴定：標(biāo)液滴定待測(cè)物，直到所滴加的試劑與待測(cè)物質(zhì)按化學(xué)計(jì)量關(guān)系定量反應(yīng)為止。返滴定法：先用過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)溶液A與待測(cè)物反應(yīng)后，再用另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液B滴定剩余的A溶液。置換滴定：先用適當(dāng)試劑與待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)，定量置換出另一種物質(zhì)，再用標(biāo)準(zhǔn)溶液去滴定該物質(zhì)的方法。Na2S2O3+K2Cr2O7S4O62-+SO42-

無(wú)定量關(guān)系K2Cr2O7+過(guò)量KI定量生成I2

Na2S2O3標(biāo)液淀粉指示劑深藍(lán)色消失第五頁(yè)，共59頁(yè)。滴定分析對(duì)化學(xué)反應(yīng)的要求：

a.反應(yīng)定量、完全 b.反應(yīng)迅速 c.具有合適的確定終點(diǎn)的方法特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速；適于常量分析；準(zhǔn)確度高；應(yīng)用廣泛。第六頁(yè)，共59頁(yè)。Ch.P（2005）中采用的滴定分析法：酸堿滴定、銀量法、碘量法、亞硝酸鈉滴定法、配位滴定法、雙相滴定法、高錳酸鉀滴定法、溴酸鉀滴定法、碘酸鉀滴定法、高碘酸鉀滴定法等。第七頁(yè)，共59頁(yè)。2.重量分析法重量分析法，是將被測(cè)組分與試樣中的其他組分分離后，轉(zhuǎn)化成一定的稱(chēng)重形式，然后用稱(chēng)重方法測(cè)定該組分的含量。重量分析法的分類(lèi)揮發(fā)重量法用加熱等方法將待測(cè)物中揮發(fā)性成分揮發(fā)后，稱(chēng)量殘?jiān)?，由樣品減少的量來(lái)計(jì)算該揮發(fā)組分的量。常用來(lái)測(cè)定物料的水分、揮發(fā)分和灰分。第八頁(yè)，共59頁(yè)。應(yīng)用例如：氯化鋇中結(jié)晶水含量的測(cè)定水分在試樣中存在的形式：吸附水，結(jié)晶吸附水：在105~110℃烘干結(jié)晶水：根據(jù)具體的物質(zhì)決定，例如BaCl2·2H2O可以在120~125℃烘干。第九頁(yè)，共59頁(yè)。

萃取重量法溶劑萃取待測(cè)物后，將萃取液蒸干，稱(chēng)量干燥物重量。Ch.P（2005）中收載苯妥英鈉的含量測(cè)定就是利用萃取重量法。（P40~41）第十頁(yè)，共59頁(yè)。

沉淀重量法利用沉淀反應(yīng)，將待測(cè)物轉(zhuǎn)化為沉淀，分離并稱(chēng)定其重量。被測(cè)組分微溶化合物↓（沉淀形式）稱(chēng)量形式稱(chēng)重計(jì)算被測(cè)組分的含量沉淀劑過(guò)濾、洗滌烘干(灼燒)第十一頁(yè)，共59頁(yè)。沉淀重量法的應(yīng)用濾，洗灼燒，800℃SO42-+BaCl2BaSO4BaSO4被測(cè)物 沉淀劑沉淀形式稱(chēng)量形式Mg2++(NH4)2HPO4

MgNH4PO4·6H2O濾，洗灼燒,1100℃

Mg2P2O7濾，洗灼燒Fe3++NH3·H2O

Fe(OH)3

Fe2O3Ch.P（2005）中收載甲磺酸酚妥拉明的含量測(cè)定。P41第十二頁(yè)，共59頁(yè)。儀器分析法色譜分析色譜法溯源俄國(guó)科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見(jiàn)諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見(jiàn)諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography50年代開(kāi)始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代第十三頁(yè)，共59頁(yè)。色譜的分類(lèi)氣相色譜：流動(dòng)相是氣相液相色譜：流動(dòng)相是液相色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高效液相色譜HPLC氣相色譜第十四頁(yè)，共59頁(yè)。高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……第十五頁(yè)，共59頁(yè)。液相色譜的基本流程圖流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器AEGBCDF進(jìn)樣閥

泵輸液分離

檢測(cè)

記錄進(jìn)樣第十六頁(yè)，共59頁(yè)。HPLC的儀器配置高壓輸液泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流動(dòng)相第十七頁(yè)，共59頁(yè)。色譜圖：HPLC圖形結(jié)果色譜圖即色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。←色譜峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值第十八頁(yè)，共59頁(yè)。液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析：基于樣品的保留時(shí)間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測(cè)器對(duì)定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用第十九頁(yè)，共59頁(yè)。HPLC在藥物分析中的應(yīng)用常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類(lèi)消炎藥等?？咕仡?lèi)藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(lèi)(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類(lèi)手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))藥物的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。HPLC應(yīng)用示例P55第二十頁(yè)，共59頁(yè)。氣相色譜法基本原理GC是以惰性氣體作為流動(dòng)相，利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同，實(shí)現(xiàn)分離的目的。當(dāng)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運(yùn)行時(shí)，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出）。由于固定相對(duì)各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同），各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過(guò)一定的柱長(zhǎng)后，便彼此分離，順序離開(kāi)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的離子流信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。第二十一頁(yè)，共59頁(yè)。氣相色譜儀第二十二頁(yè)，共59頁(yè)。

氣相色譜儀通常由五部分組成：Ⅰ載氣系統(tǒng)：氣源、氣體凈化器、供氣控制閥門(mén)和儀表。Ⅱ進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器、汽化室。Ⅲ分離系統(tǒng)：色譜柱、控溫柱箱。Ⅳ檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器、檢測(cè)室。Ⅴ 記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀、色譜工作站。第二十三頁(yè)，共59頁(yè)。氣相色譜結(jié)構(gòu)流程1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-色譜柱；9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測(cè)系統(tǒng)溫控系統(tǒng)第二十四頁(yè)，共59頁(yè)。應(yīng)用舉例定量分析：a.色譜峰的測(cè)量:以峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)的聯(lián)線作為峰底。從峰高極大值對(duì)時(shí)間鈾作垂線，對(duì)應(yīng)的時(shí)即為保留時(shí)間。從峰頂至峰底間的線段即為峰高。b.計(jì)算:由色譜峰量出各組分的峰高，然后在各自的校準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的待測(cè)物濃度。定性結(jié)果：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖各組分的保留時(shí)間確定被測(cè)試樣中出現(xiàn)的組分?jǐn)?shù)目和組分名稱(chēng)。苯系物氣相色譜圖第二十五頁(yè)，共59頁(yè)。平面色譜在平面上進(jìn)行分離的一種色譜方法，主要包括薄層色譜法和紙色譜法。分類(lèi)薄層色譜法：吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻薄層色譜法紙色譜法：分配薄層電泳法第二十六頁(yè)，共59頁(yè)。定性參數(shù)比移值(Rf值)溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比。Rf=L/L0

L為原點(diǎn)（origin）至斑點(diǎn)中心的距離，L0為原點(diǎn)至溶劑前沿（solventfront）的距離

與組分及色譜條件有關(guān)

第二十七頁(yè)，共59頁(yè)。薄層色譜法固定相（吸附劑或載體）涂布成一均勻薄層，點(diǎn)樣，（密閉的容器中）展開(kāi)，斑點(diǎn)顯色，（與對(duì)照物質(zhì)）比較進(jìn)行定性定量。操作步驟：制板（均勻）→點(diǎn)樣（集中）→展開(kāi)(多種方式)→顯色（紫外燈或顯色劑）

(thinlayerchromatography；TLC)第二十八頁(yè)，共59頁(yè)。定性和定量分析定性分析

比較Rf值、斑點(diǎn)顏色或熒光常采用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照（同一板上展開(kāi)）多種展開(kāi)系統(tǒng)的Rf值與對(duì)照品一致。定量分析

洗脫法直接定量法1.目視比較法（如雜質(zhì)限度檢查方法）2.薄層掃描法第二十九頁(yè)，共59頁(yè)。應(yīng)用示例中藥中化學(xué)成分的分析例1，如右上圖，不同產(chǎn)地的甘草的TLC圖譜。例2，某中藥的TLC圖譜與HPLC圖譜對(duì)照。第三十頁(yè)，共59頁(yè)。光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過(guò)測(cè)量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行分析的方法。

吸收光譜分析發(fā)射光譜分析分子光譜分析原子光譜分析光譜分析第三十一頁(yè)，共59頁(yè)。

在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法稱(chēng)為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動(dòng)光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍2.51000m,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

可見(jiàn)吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。第三十二頁(yè)，共59頁(yè)。紫外-可見(jiàn)分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)它是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外-可見(jiàn)光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析,所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長(zhǎng)的光而產(chǎn)生的吸收光譜，即為紫外光譜。第三十三頁(yè)，共59頁(yè)。紫外光譜的表示法紫外光譜圖是由橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)和吸收曲線組成的。

橫坐標(biāo)表示吸收光的波長(zhǎng)，用nm（納米）為單位?？v坐標(biāo)表示吸收光的吸收強(qiáng)度，可以用A(吸光度)、T(透光率)、1-T(吸收率)中的任何一個(gè)來(lái)表示。吸收曲線表示化合物的紫外吸收情況。曲線最大吸收峰的橫坐標(biāo)為最大吸收波長(zhǎng)。對(duì)甲苯乙酮的紫外光譜圖第三十四頁(yè)，共59頁(yè)。在藥物分析中的應(yīng)用UV-Vis分光光度法主要用于藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定中。應(yīng)用一：藥品的鑒別測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)例如三唑侖，用無(wú)水乙醇制成每1ml中含5μg的溶液，照分光光度法測(cè)定，在221nm處有最大吸收。測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)和最小吸收波長(zhǎng)如五氟利多測(cè)定最大波長(zhǎng)和不同波長(zhǎng)的吸收值比值測(cè)定吸收系數(shù)第三十五頁(yè)，共59頁(yè)。例:在頭孢類(lèi)抗生素中，常在性狀項(xiàng)下規(guī)定吸收系數(shù)，以控制藥品的質(zhì)量。藥品溶劑λmax/nm頭孢他啶磷酸緩沖液pH6.0257400~430頭孢曲松鈉水241495~545頭孢克洛水264230~255頭孢呋辛酯甲醇271390~292頭孢氨芐水262220~245第三十六頁(yè)，共59頁(yè)。應(yīng)用二：藥品的雜質(zhì)檢查用分光光度法對(duì)藥品中的特殊雜質(zhì)進(jìn)行檢查，可將雜質(zhì)用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛?，與主成分分離后測(cè)定，還可用雜質(zhì)的顯色反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。如維生素B2中感光黃素的檢查取本品25mg，加無(wú)乙醇氯仿10ml，振搖5min，濾過(guò)，濾液照分光光度法，在440nm處測(cè)定，吸收度不得過(guò)0.016。第三十七頁(yè)，共59頁(yè)。應(yīng)用三：藥品的含量測(cè)定UV-Vis分光光度法簡(jiǎn)便，快速，在藥物的含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。含量測(cè)定時(shí)通常選擇最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定供試品的吸收度，用對(duì)照品或百分吸收系數(shù)（）計(jì)算藥品的含量。如藥典中乙胺嘧啶片的含量測(cè)定P70第三十八頁(yè)，共59頁(yè)。紅外光譜法藥物受到紅外區(qū)電磁波的輻射，激發(fā)分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的變化，產(chǎn)生紅外吸收光譜。有機(jī)分子中的許多官能團(tuán)具有特征的振動(dòng)能級(jí)，相應(yīng)于IR光譜一定區(qū)域的特征吸收帶，可用于鑒別這些官能團(tuán)。此外，有大量的標(biāo)準(zhǔn)光譜和數(shù)據(jù)庫(kù)可資比較，常?？梢詫?duì)藥物結(jié)果作出確切的鑒定。第三十九頁(yè)，共59頁(yè)。紅外光譜分析的應(yīng)用在藥物分析中，紅外光譜主要用于定性鑒別。定性鑒別時(shí)，主要著眼于供試品光譜與對(duì)照光譜全譜譜形的比較，即首先是譜帶的有與無(wú)，然后是各譜帶的相對(duì)強(qiáng)弱。若供試品的光譜圖與對(duì)照光譜圖一致，通?？膳卸▋苫衔餅橥晃镔|(zhì)（除光學(xué)異構(gòu)體）。若兩光譜不同，則可判定兩化合物不同。第四十頁(yè)，共59頁(yè)。示例1：紅外光譜鑒別青霉素類(lèi)藥物P78

示例2：芐醇的紅外光譜第四十一頁(yè)，共59頁(yè)。質(zhì)譜分析質(zhì)譜法是一種按照離子的質(zhì)核比（m/z）大小對(duì)離子進(jìn)行分離和測(cè)定的方法。分析時(shí)，首先將分子離子化，然后利用離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，把離子按質(zhì)核比大小排列成譜，此即為質(zhì)譜。 質(zhì)譜法的主要作用是：（1）準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量（2）根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析第四十二頁(yè)，共59頁(yè)。質(zhì)譜分析過(guò)程和原理第四十三頁(yè)，共59頁(yè)。質(zhì)譜法分類(lèi)按用途分有機(jī)質(zhì)譜無(wú)機(jī)質(zhì)譜同位素質(zhì)譜按原理分單聚焦質(zhì)譜雙聚焦質(zhì)譜四極質(zhì)譜飛行時(shí)間質(zhì)譜回旋共振質(zhì)譜按聯(lián)用方式分氣質(zhì)聯(lián)用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)質(zhì)聯(lián)用第四十四頁(yè)，共59頁(yè)。 進(jìn)樣系統(tǒng)(inletsystem) 離子源(ionsource) 質(zhì)量分析器（massanalyzer） 檢測(cè)器（detecter） 真空系統(tǒng)（Vacuumsystem）質(zhì)譜儀的組成1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離4.激光

1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時(shí)間4.四極桿

進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器

離子源的真空度應(yīng)達(dá)到10-3-10-5Pa，質(zhì)量分析器應(yīng)達(dá)到10-6Pa。第四十五頁(yè)，共59頁(yè)。有機(jī)質(zhì)譜譜圖及信息表達(dá)分子離子(CH2Cl2+)同位素離子(Cl)碎片離子(CH2Cl+)二氯甲烷的電子轟擊質(zhì)譜第四十六頁(yè)，共59頁(yè)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為一種高效的定性定量分析工具。中藥未知成分的鑒定，LC-MS測(cè)定雷公藤的化學(xué)組分揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析藥物代謝研究，液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法檢測(cè)體液中士的寧、馬錢(qián)子堿及其主要代謝物。質(zhì)譜在藥物分析結(jié)構(gòu)鑒定中起著重要的作用，主要用于判定藥物的分子量和分子式。第四十七頁(yè)，共59頁(yè)。24113410677第四十八頁(yè)，共59頁(yè)。電化學(xué)分析法電化學(xué)分析是根據(jù)電化學(xué)原理建立起來(lái)的一類(lèi)分析方法。電化學(xué)分析法主要是應(yīng)用電化學(xué)的基本原理和技術(shù)，研究在化學(xué)電池內(nèi)發(fā)生的特定現(xiàn)象，利用物質(zhì)的組成及含量與它的電化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系而建立起來(lái)的一類(lèi)分析方法。第四十九頁(yè)，共59頁(yè)。定性和定量分析依據(jù)分析方法：設(shè)計(jì)電池，使得試樣溶液成為電化學(xué)電池的組成部分，然后測(cè)量電池的某些參數(shù)（電壓、電流、電阻、電量等），或根據(jù)這些參數(shù)的變化來(lái)進(jìn)行待測(cè)組分的定量或定性分析。基本原理利用電池電動(dòng)勢(shì)與試液中離子活度之間一定