基因表達(dá)的檢測課件

基因表達(dá)檢測第三部分：RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

ReverseTranscriptionPCR

RNA抽提cDNA反轉(zhuǎn)錄基因特異性引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)PCRNorthernBlotting基因表達(dá)分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表達(dá)水平（梁大成等，2006）mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達(dá)的常用方法。

實(shí)驗(yàn)原理被污染的試劑，緩沖液移液器使用的器皿及tip等操作者的手，頭發(fā)等

RNA操作中應(yīng)注意的問題：防止RNase污染外源RNase的主要來源：當(dāng)處理RNA時，移液器專用保證RNA實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿、塑料制品和緩沖液等留出專用；溶液和試劑分裝成小份保存；RNA電泳裝置專用（清洗、處理、DEPC處理過的水沖洗）；防止外源RNase污染的主要措施(一）：材料要新鮮;裂解過程要同RNase活性抑制同步防止內(nèi)源RNA酶降解RNARNA酶抑制劑RNA酶是一種強(qiáng)有力的酶，在RNA分離和鑒定的各個階段嚴(yán)重威脅RNA的完整性。用來使RNA酶不發(fā)揮作用的RNA酶抑制劑主要有：DEPC(Diethyl-pyrocarbonate)或DMDC(Dimethyl-dicarbonate)氧釩核糖核苷復(fù)合物

RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑DEPC:是高度活性的烷基化試劑，通過組胺基團(tuán)乙氧基甲酸化形式破壞RNase的活性O(shè)CCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧釩核糖核苷復(fù)合物:能與多種RNA酶活性位點(diǎn)結(jié)合并幾乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNAEXTRACTION(miniprep)

RNA的制備與分析對于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)和cDNA的合成都是必須的，RNA的純度和完整性對于Northernblot,RT-PCR和cDNA文庫的構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。RNA分離的方法很多，最關(guān)鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)RNA的簡易制備過程，通過RNA電泳帶評價RNA質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)材料：水稻幼嫩葉片

苯酚/氯仿反復(fù)抽提，價廉但質(zhì)不優(yōu)，尤其是對多酚等含量高的材料不適蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法強(qiáng)變性劑法。硫氰酸胍，鹽酸胍等，可配合氯化銫離心或有機(jī)溶劑提取。

TrizolReagent提取方法：75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿異丙醇（RNA專用）RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate

（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：

應(yīng)戴口罩和手套，環(huán)境潔凈；玻璃器皿180oC烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白質(zhì)變性劑處理；一次性用品如tube,tip等使用新的，無RNA酶的產(chǎn)品。RNA抽提前應(yīng)準(zhǔn)備的其它試劑及物品：操作步驟（一）液氮磨樣，每管分裝0.1克樣品；每管加1毫升Trizol

試劑（樣品體積不超過Trizol

試劑體積的10％），迅速混勻（若樣品較多可先將混好的樣品置于冰上）；室溫下凈置5－10分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離；加200μl的氯仿，用手劇烈搖蕩15秒，室溫下靜置5分鐘左右；4.2-8℃

，12000×g離心10-15分鐘；將水相（上清）轉(zhuǎn)入一新離心管，加0.5ml異丙醇室溫下沉淀10分鐘；2-8℃

，12000×g離心15分鐘；棄上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振蕩片刻后（務(wù)必使沉淀懸浮起來，以確保洗滌干凈），7500×g離心5分鐘，小心棄上清；室溫靜置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20μlDEPC水溶解，保存于-70℃

。取2μl瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。操作步驟（二）In1×MOPS80—150V40min—1h30min電泳有溴化乙錠存在時，電泳后28SrRNA和18SrRNA在紫外燈下應(yīng)當(dāng)很清楚的看得到，還應(yīng)當(dāng)有一條由tRNA，5.8SrRNA和5SrRNA組成的較模糊的遷移較快的帶。如果RNA沒有降解，28SrRNA的亮度應(yīng)當(dāng)是18SrRNA的2倍，且這兩條帶都沒有彌散現(xiàn)象。WhatdoesgoodorbadtotalRNAlooklikewhenseparatedingel?CallusLeafDegradationContaminantGoodRNA產(chǎn)量低的原因樣品研磨不徹底，沒有混勻，裂解不徹底RNA沒有完全溶解DNA污染的原因樣品太多，所加試劑相對太少用來分離RNA的樣品中含有機(jī)溶劑（乙醇，DMSO等），或堿溶液等RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)RT-PCR的原理及其操作過程實(shí)驗(yàn)材料：水稻幼嫩葉片RNA

單鏈多肽，具有聚合酶和較弱的RNaseH活性（或RNaseH－），最適反應(yīng)條件：37°C,pH8.3,反轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV：禽成髓細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄酶AMV2條多肽鏈，具有聚合酶活性和較強(qiáng)的RNaseH活性，最適反應(yīng)條件41-45°C，pH8.3比pH7.6活性高RNaseH：催化DNA-RNA雜合體的RNA部分的降解，產(chǎn)生不同鏈長帶3‘羥基和5’磷酸末端的寡核苷酸。RibonucleaseInhibitor單一多肽，可與RNaseA形成1：1非共價的復(fù)合物，從而使RNA酶失活。不能在變性劑如SDS、胍等存在的情況下使用。活性表達(dá)需要巰基化試劑（DTT）本實(shí)驗(yàn)以水稻葉片RNA為材料，檢測β-actin基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置一個陰性對照：不加模板RNA，主要是消除DNA及PCR試劑方面引起的假陽性；同時以葉片DNA為陽性對照，檢驗(yàn)PCR試劑和擴(kuò)增過程是否有問題實(shí)驗(yàn)設(shè)計操作步驟（一）RNAPreparationPreparetheplanttotalRNAbyTRIzolReagent.DilutetheTotalRNAtothefinalconcentrationof1g/lbyDU640..Combinethefollowingina0.5mlsterileeppendorftube:TotalRNA 3l

(2-5g)

RNase-freeDNase

１l(１u/l)10×DNase

buffer 1laddDEPC-treatedddH2O5lIncubateat37℃for15min,then70℃for10min.操作步驟（二）ReverseTranscriptaseReaction

Add1l500g/mloligo(dT)15primer,mixthecontentsofthetubebygentlyvortexingandcollectthereactionbybriefcentrifugation.Heatthemixtureat70℃drybathfor10minutes,thenputonicefor5minutes.Addthefollowingcontents: 5×firststrandbuffer 4l 0.1MDTT 2l 10MdNTP 1lM-MLV(200U/l)

1l

操作步驟（二）4.incubateat37℃for1h.(Thetotalvolumeshouldnowbe20l)5.Inactivethereactionbyheatingat70℃for10min,thenadd20lddH2OandthefirststrandofcDNAcanbeusedasatemplatetoamplificationinPCR.6.ToremovetheRNAcomplementarytothecDNA,add1l(2units)ofRNaseHandincubateat37℃for20min.PCR技術(shù)PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)〕是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，是分子克隆技術(shù)中最常用的技術(shù)之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。TheInventionofPCRInventedbyKaryMullisin1983.Firstpublishedaccountappearedin1985.AwardedNobelPrizeforChemistryin1993.模板DNA：一般102－105個拷貝Mg2＋：Mg2＋能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。一般反應(yīng)體系中1.5-2.5mmol/L反應(yīng)反沖液：使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。dNTP：在PCR反應(yīng)體系中其濃度一般為20－200mol/L，濃度過高、過低都不利。TaqDNA聚合酶：在70－75C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，無校正功能。是鎂依賴性酶。引物：PCR反應(yīng)中引物濃度一般為0.1－0.5mol/L。PCR反應(yīng)體系中的主要成分及其作用：變性：模板DNA由雙鏈變成單鏈，使有利于與引物結(jié)合?？筛鶕?jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時間，一般情況下94C30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性（過高的溫度或高溫持續(xù)時間過長，可對TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成損害）。退火：變性的DNA快速冷卻至40－60C可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合?？筛鶕?jù)引物的長度和G＋C的含量選擇復(fù)性溫度。退火時間30秒。延伸：一般是70－75C，此時TaqDNA聚合酶活性最高。<1kb，1分鐘；>1kb的可適當(dāng)延長時間。循環(huán)次數(shù)：理論上20－25個循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計即可達(dá)到最大值、實(shí)際操作中25－30較合理。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量也會增加。循環(huán)條件的設(shè)定：ThermalCyclersPCRmachineavailablefrommanysuppliers.Manyblockformatsandmulti-blocksystems.Reactionsintubesor96-wellmicro-titreplates.在冰上配制下列反應(yīng)體系: FirststrandcDNA 1l

TaKaRaExTaq(5u/1l) 0.5l 10×ExTaqbuffer 2l

dNTPmixture(2mM) 2l PrimerF(10mM) 0.5l PrimerR(10mM) 0.5l ddH2O 13.5l混勻后，短暫離心，每管加一滴礦物油。操作步驟（三）PCRPCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

根據(jù)引物及基因的表達(dá)水平設(shè)置循環(huán)參數(shù)：如引物序列、引物長度、擴(kuò)增片段的長度及mRNA的豐度等檢測：加2l溴酚藍(lán)，混勻，取15l反應(yīng)產(chǎn)物電泳；在1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。

RT反應(yīng)程序：94度45秒，58度45秒，72度60秒，27CYCLES.Genome:750bpcDNA:250bp2KBcDNAZH11H2OGAL4反應(yīng)程序：94度45秒，58度45秒，72度60秒，30CYCLES.Size:630bpTaq酶過多；Mg2+濃度不合適；引物濃度過高或設(shè)計不合理；復(fù)性溫度過低；循環(huán)次數(shù)過多；模板量過多；PCR產(chǎn)物的電泳檢測時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶的可能原因：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測OptimisingtheAnnealingTemperaturePrimershaveacalculatedannealingte