利用基因工程技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)課件

第四章利用基因工程技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)本章的重點(diǎn)內(nèi)容：1.什么是基因工程？2.獲得目的基因的方法有哪些？3.DNA雙脫氧測(cè)序技術(shù)的基本原理。

4.PCR技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用。5.基因定點(diǎn)突變技術(shù)及其應(yīng)用。6.表達(dá)載體的構(gòu)建策略與技術(shù)方法。

7.如何根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列獲得其基因？第一節(jié)基因工程原理簡(jiǎn)介一、基因工程的定義本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設(shè)計(jì)的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行切割和連接，構(gòu)建成正確的重組表達(dá)載體，再應(yīng)用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將該表達(dá)載體導(dǎo)入到細(xì)菌、動(dòng)植物細(xì)胞或受精卵中，使目的基因在宿主體內(nèi)以瞬時(shí)方式或穩(wěn)定方式進(jìn)行表達(dá)，借此研究目的基因的結(jié)構(gòu)與功能，或獲得該基因的表達(dá)產(chǎn)物。這一過(guò)程就是基因工程。

廣義：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；克?。换虼虬?；基因組計(jì)劃等均屬于基因工程的范疇。目的基因獲得表達(dá)載體構(gòu)建基因的導(dǎo)入整合與表達(dá)的鑒定二、基因工程的基本步驟表達(dá)產(chǎn)物的提取、純化與鑒定真核細(xì)胞總RNA的電泳結(jié)果：核酸電泳技術(shù)

1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS500200010007501002001DL2000marker2BamHI和EcoRI雙切3BamHI單切4HindⅢ單切5重組質(zhì)粒pVAX1/ABPS112345二、一些重要技術(shù)原理介紹

重點(diǎn)介紹DNA雙脫氧測(cè)序技術(shù)，核酸探針技術(shù)，PCR技術(shù)等。（一）DNA雙脫氧測(cè)序

1.Dotblot2.Southernblot：DNA3.

Northernblot:RNA（三）PCR技術(shù)

1.基本原理

2.引物設(shè)計(jì)1)長(zhǎng)度;2)GC%;3)stem-loop;4)dimer;5)錯(cuò)配;6)5’末端可以不配對(duì)3.應(yīng)用:科學(xué)研究；醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)臨床。KaryB.MullisLaJolla,CA,USA.B.1944DNA生物合成與PCR方法合成DNA的異同點(diǎn):1.相同點(diǎn)：均為酶促反應(yīng)；均需要模板和引物；底物為dNTP；半保留復(fù)制；均為5’3’方向復(fù)制。2.不同點(diǎn)：1）反應(yīng)條件不同：體內(nèi)為生理?xiàng)l件，體外為94℃、52℃及72℃等變溫條件；2）參與反應(yīng)的物質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量不同；3）引物不同，體內(nèi)為RNA，體外為DNA，且在DNA合成后，前者被切除掉，后者作為終產(chǎn)物的一部分；4）體內(nèi)為半不連續(xù)合成，體外為連續(xù)合成；5）體內(nèi)單復(fù)制原點(diǎn)或多復(fù)制原點(diǎn)，單方向或雙方向復(fù)制；6）體內(nèi)受細(xì)胞周期的調(diào)控，體外按人們的意愿進(jìn)行；7）體內(nèi)具有校正、修復(fù)的功能（錯(cuò)配率較低），體外無(wú)（錯(cuò)配率較高）；8）體內(nèi)DNA的復(fù)制為全部染色體DNA的復(fù)制，體外僅復(fù)制兩引物之間的DNA序列。（四）目的基因的改造技術(shù)1.引物介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變技術(shù)2.盒式突變(cassettemutagenesis)

3.GenesShuffling四、獲得目的基因的方法

基因文庫(kù)（基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)），化學(xué)合成，PCR等方法。還有DD-PCR以及基因芯片等技術(shù)。（一）基因組文庫(kù)目的：種質(zhì)資源的保護(hù)；基因組測(cè)序；基因組基因或調(diào)控序列的克隆等。

家蠅卵黃蛋白基因組基因的克隆和序列分析

結(jié)果1:GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黃蛋白基因部分DNA片段特異性探針序列特異性探針制備

制備了大小為768bp的地高辛標(biāo)記的DNA片段特異性探針，工作濃度為1:2000。結(jié)果2:

陽(yáng)性克隆的篩選和純化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3Screeningresultof1stroundinsituhybridization圖3第一次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果YP1

2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4Screeningresultof2ndroundinsituhybridization圖4第二次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果Numbers：11positiveclone（11plaques/plate）Fig.5Screeningresultof3rdroundinsituhybridization圖5第3次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果獲得了含家蠅卵黃蛋白基因的陽(yáng)性克隆2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG22002201CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC23002301ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG24002401AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC25002501TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC26002601TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG27002701CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA28002801TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA29002901ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA30003001AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT31003101TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA32003201AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT33003301TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG34003401AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA35003501GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT36003601TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT37003701TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC38003801CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC39003901TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG3991圖3.卵黃蛋白基因組基因全序列（二）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后的

差異表達(dá)研究（三）DD-PCR技術(shù)5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn細(xì)胞總RNA或poly(A)RNA

5’N’M’AAAAAAAAAAAAAncDNA3’NMTTTTTTTTTTTT簡(jiǎn)并錨定引物

進(jìn)行PCR

隨機(jī)十聚體NNNNNNNNNN——————————————————————NMTTTTTTTTTTTT持續(xù)循環(huán)

NNNNNNNNNN————————————

——————————NMTTTTTTTTTTTT

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品A樣品B作Northern探針作cDNA文庫(kù)篩選探針作亞克隆和測(cè)序樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)切取目的帶,重新擴(kuò)增,回收純化

五、重組質(zhì)粒（表達(dá)載體）的構(gòu)建與鑒定1.DNA（載體和目的片段）的酶切與回收。2.目的片段與載體的連接。二者的摩爾比應(yīng)滿(mǎn)足以下比例：粘端：3~5:1；鈍端：6~8:13.轉(zhuǎn)化與重組質(zhì)粒的篩選、鑒定。1）初步鑒定：抗性；α-互補(bǔ)；快速鑒定；原位雜交；PCR。2）酶切鑒定：大小和方向。3）測(cè)序鑒定：雙脫氧測(cè)序法。六、基因?qū)爰夹g(shù)（一）細(xì)菌

1.氯化鈣；2.電穿孔技術(shù)。（二）細(xì)胞1.脂質(zhì)體；2.磷酸鈣；3.電穿孔；4.顯微注射；5.VirusVector。（三）受精卵1.顯微注射；2.電穿孔技術(shù)；3.精子載體；4.ESC；5.VirusVector（

RT-VorLentivirus-V）。七、常用表達(dá)系統(tǒng)（一）原核表達(dá)系統(tǒng)：包涵體；分泌型。

已成功的基因工程產(chǎn)品絕大部分是利用原核系統(tǒng)生產(chǎn)的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。（二）真核表達(dá)系統(tǒng)：傳代細(xì)胞；酵母；生物反應(yīng)器等。1.傳代細(xì)胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等；2.酵母：畢赤（甲醇）酵母。3.生物反應(yīng)器：如乳腺、血液、尿液、雞蛋、昆蟲(chóng)等。世界上第一個(gè)動(dòng)物（山羊）乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)品—重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn

）于2006年獲準(zhǔn)上市。由全球最著名的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研發(fā)企業(yè)——美國(guó)Genzyme轉(zhuǎn)基因公司研制成功。重組蛋白動(dòng)物生產(chǎn)公司LA,α-LA,單抗,溶菌酶,牛AdvancedCellTechnology,GeneticGH,INS,HSA牛SavingsandClone,Infigen,PharmingATⅢ,tPA,單抗,GH,α1-抗胰蛋白酶山羊GenzymeTransgenics,NexiaBiotechnologies,PPLtherapeutics纖維蛋白原表面蛋白B,原膠原重組抗體小鼠Abgenix,Medarex凝血因子Ⅷ，蛋白C,血紅蛋白豬Alexion,Biotransplant,PPLTherapeuticsCT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,細(xì)胞外SOD,兔Pharming,PPLTherapeuticsa2-葡糖苷酶,糖原樣肽兔Pharming,PPLTherapeuticsα1-抗胰蛋白酶,凝血因子Ⅷ,Ⅸ,綿羊

PPLTherapeuticsIGF-1,纖維蛋白原綿羊PPLTherapeuticsNATUREBiotechnology,October,2000表1.部分已表達(dá)的蛋白質(zhì)蛋白/肽公司開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀治療疾病國(guó)外公司已開(kāi)發(fā)的部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品DevelopmentstatusofaselectedlistofproteinsproducedbytransgenicanimalsABX-IL8mAbAbgenix臨床I/II牛皮癬ABX-EGFmAbAbgenixPreclinicalEGF-依賴(lài)性癌癥a-1-抗胰蛋白酶PPLTherapeuticsPhaseII膽囊纖維化a-1蛋白酶抑制劑GenzymeTransgenicsR&D遺傳缺陷β-IFNGenzymeTransgenicsR&D多發(fā)性硬化膠原IIPharmingPreclinical風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎因子VIIPPLTherapeuticsPreclinical出血時(shí)因子X(jué)IPPLTherapeuticsPreclinicalB型血友病纖維蛋白原PPLTherapeuticsPreclinical外傷和手術(shù)時(shí)作組織膠粘劑胰高血素樣肽-1PPLTherapeuticsR&DII-型糖尿病人GHGenzymeTransgenicsR&D身體生長(zhǎng)發(fā)育，脂肪動(dòng)員HASGenzymeTransgenicsR&D血漿膨脹劑和藥物賦形劑MSP-1(瘧疾苗)GenzymeTransgenicsR&D瘧疾蛋白CPPLTherapeuticsPreclinical防止深部靜脈的血栓形成降鈣素(salmon)PLLTherapeuticsPreclinical骨質(zhì)疏松tPAGenzymeTransgenicsR&D心肌梗塞和非栓塞（三）提高真核表達(dá)效率的技術(shù)方法1.選用強(qiáng)啟動(dòng)子，如CMV、EF1α等；2.組成型表達(dá)（可誘導(dǎo)表達(dá)）；3.增強(qiáng)子，如MAR序列；4.poly(A)；5.Dhfr加壓篩選系統(tǒng)；6.串聯(lián)表達(dá)；7.穩(wěn)定表達(dá)（瞬時(shí)表達(dá)）；8.Kozak序列。基因組序列的選擇性擴(kuò)增—染色體擴(kuò)增以dhfr基因的擴(kuò)增為例，說(shuō)明基因組序列的選擇性擴(kuò)增機(jī)制。二氫喋啶FH2FH4CoF衍生物合成嘌呤或嘧啶注：

（1）合成酶；（2）還原酶。（1）（2）

染色體擴(kuò)增的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)特定基因拷貝數(shù)的專(zhuān)一性大量擴(kuò)增(amplification)。（Amplificationreferstotheproductionofadditionalcopiesofachromosomalsequence,foundasintrachromosomalorextrachromosomalDNA.）葉酸四氫葉酸MammaliangenesforDHFR(dihydrofolatereductase)havethesamerelativeorganizationofrathershortexonsandverylongintrons,butvaryextensivelyinthelengthsofcorrespondingintrons.1.類(lèi)型：

Unstablelines

andStablelines

Inunstablelines,theamplifiedgenesareatleastpartiallylostwhentheselectivepressureisreleased,becausetheamplifiedgenesexistasanextra-chromosomalarray.Instablelines,theamplifiedgenesareretained,becausetheyresideonthechromosome,atthesiteusuallyoccupiedbythesingledhfrgene.Usuallytheotherchromosomeretainsitsnormalsinglecopyofdhfr.