實驗三Feulgen反應顯示DNA20093課件

實驗三

Feulgen反應顯示DNA一、實驗目的1．掌握臨時制片法。

2．熟悉Feulgen反應的原理及操作步驟。

3．觀察細胞中DNA的分布二、實驗原理DNA經酸（1mol/LHCl）水解后，分子中的嘌呤和脫氧核糖連接的配糖鍵被打開，脫氧核糖的一端釋放出游離的醛基，并在原位與Schiff試劑反應形成特異性的紫紅色產物。該產物能特異地吸收550~570nm的光波。并且在一定的濃度范圍內對550~570nm光波的吸收值與DNA含量成正比關系，符合化學計量學關系。對照組或采取不經鹽酸處理，或預先用熱三氯醋酸或DNA酶處理，抽提去細胞中的DNA而得到陰性反應，從而證明此反應的專一性。此法既可定位用于細胞或組織化學染色反應，觀察DNA的分布，又可用顯微分光光度計和圖像分析儀對細胞或組織中DNA的含量進行定量分析。Schiff試劑是由堿性品紅和偏重亞硫酸鈉/鉀作用，形成無色的品紅液。無色品紅與醛基結合則形成紫紅色的化合物，這是因為反應產物的分子內含有發(fā)色基團醌基所引起的。三、實驗器具與藥品l

每一個學生復式顯微鏡（帶油浸物鏡）（microscope）l每一組學生擦鏡紙；記號筆；小片濾紙；載玻片；鑷子；移液槍四膜蟲培養(yǎng)液（200μl）；大染色缸：Carnoy固定液；Schiff試劑（鋁箔包裝）；1mol/LHCl；自來水

l

每四個學生香柏油、二甲苯；小槍頭；亮綠整個實驗班恒溫水浴鍋兩臺，烘箱一臺染色缸平面示意圖載玻片2．固定、染色、觀察：

以下1~7步操作在染色缸中進行。（注意：載玻片插入染色缸中應插在凹槽中，盡量避免兩片載玻片貼在一起，否則會摩擦掉上面的細胞。）(1)將干燥好的2片細胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分鐘，取出，平置在濾紙上，吸去玻片背面的液體。（濾紙不要擦載玻片正面。）(2)將其中一片標本（樣品）放入1mol/L鹽酸中，60℃水浴15分鐘（注意不要打翻染色缸）；另一片標本（對照）放在空氣中，令其自然干燥。(3)將以上兩標本同時放入Schiff氏液中作用45分鐘（30℃培養(yǎng)箱）。（注意不要搞混樣品和對照。）(4)自來水浸泡1分鐘，提出載玻片，平置在濾紙上。（5）倒去染色缸中液體，再加入干凈的自來水，重復（4）操作。(6)0.1％亮綠水溶液復染2秒鐘（將載玻片浸入溶液后隨即提出）。(7)在干凈的自來水稍加浸泡，去掉浮色，濾紙吸去玻片背面和兩側的水分。（濾紙不要擦載玻片正面）(8)空氣中干燥，顯微鏡觀察。比較兩個標本的差異。

實驗流程涂片（2片/人）樣品對照干燥鹽酸水浴60℃15mSchiff試劑30℃45m對照片空氣干燥自來水浸洗1m/兩次亮綠復染2sCarnoy固定20m自來水浸洗去浮色干燥鏡檢介紹：四膜蟲（Tetrahymena）四膜蟲與草履蟲一樣，都是單細胞原生動物，屬纖毛蟲綱。一般呈梨形。四膜蟲有兩個細胞核，大核位于細胞中部，直徑約10微米，小核位于大核附近，直徑為1.52微米。小核具5對染色體，其基因不轉錄，對細胞表型無影響。在有性生殖過程中，小核經配子核交換發(fā)育產生新大核，同時舊大核退化。大核中的基因活躍地轉錄，決定了細胞的表型。核酶的發(fā)現(xiàn)：1981年Cech等發(fā)現(xiàn)，四膜蟲rDNA轉錄rRNA前體分子不需要酶，可以自己精確地將26SrRNA中的一段內含子切除下來，并將兩側的RNA拼接起來形成完整的26SrRNA。端粒結構及其復制機制的闡明：1978年，Blackburn以四膜蟲rDNA為材料，首次揭示了染色體端粒序列的真實存在，并進而在其他生物中獲得了證實，接著又在四膜蟲體內分離出了端粒酶，并于1989年證明這種酶本身就帶有一段RNA序列，后者正是染色體DNA端粒序列復制的模板，從而基本搞清了染色體中線型DNA分子復制時維持其完整性的機制。四膜蟲大核中存在上萬個來自于小核單一拷貝rRNA基因的rDNA分子，具有高度的同源性。這一特性，使四膜蟲成為研究rRNA基因轉化的難得的材料。五、實驗結果

實驗組經Feulgen反應顯示核結構細致、清晰，細胞核染成粉紅色至紫紅色，核仁不著色。經亮綠處理的細胞的細胞質部分顯綠色。對照組由于DNA沒有釋放出醛基，細胞核顯示出被亮綠染上的綠色，無紅色出現(xiàn)。如果亮綠處理時間過長，則會造成細胞核區(qū)顏色過深。六、注意事項涂片時最好在載玻片上端一角做好標記，以免實驗時弄反正反面。涂片區(qū)不要超過載玻片長度的1/2，涂成直徑約為1cm左右的圓。涂片完需待其完全干燥后（可置于溫箱中使其快干），方可置Carnoy固定液中固定，否則涂上的細胞會大量脫落。酸水解時必須掌握合適的濃度、水解溫度和時間，如果酸水解不足，會造成醛基暴露不完全；反之會造成DNA間鍵的斷裂溶解，對DNA的定量測量產生不良影響。在Schiff試劑中染色（切記在避光處反應）時，如室溫過低會影響染色效果，使染色極淺。可適當加溫（置于30度左右溫箱中）或延長反應時間。亮綠濃度不能過高，染色時間不能過長，否則整個細胞包括細胞核區(qū)均會染色過深而看不出紫紅色。

八、思考題1、比較Feulgen反應與Brachet反應（可從對象