實(shí)驗(yàn)一堿變性法抽提質(zhì)粒DNA課件

梁曉紅王曉燕2011-6醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基因克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)部分共100分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)60%考勤+實(shí)驗(yàn)報(bào)告40%實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（3000~4000字）：選題：結(jié)合自己的專業(yè)，利用基因工程技術(shù)內(nèi)容：1）立題依據(jù)；2）原理；3）實(shí)驗(yàn)材料；4）實(shí)驗(yàn)方法；5）預(yù)期結(jié)果；6）參考文獻(xiàn)（＞3篇）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1）項(xiàng)目完整35分；2）創(chuàng)新性15分；3）可行性5分；4）合理性5分。注意事項(xiàng)1.分組（4人/組）2.隔離衣3.離心機(jī)、移液器等使用總體實(shí)驗(yàn)安排上午下午1堿變性抽提質(zhì)粒DNA核酸濃度和純度分析核酸電泳及分子量測(cè)定質(zhì)粒DNA的酶切2感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)粒DNA的酶切產(chǎn)物電泳試劑盒回收DNA目的基因與載體的連接3重組子篩選、鑒定方法藍(lán)白斑篩選真核基因組DNA抽提1連接子的轉(zhuǎn)化真核基因組DNA抽提24菌落的PCR鑒定PCR產(chǎn)物的電泳實(shí)驗(yàn)一堿變性法抽提質(zhì)粒DNA質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:

嚴(yán)緊控制型(Strengentcontrol)：復(fù)制受宿主細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控，拷貝數(shù)低；松馳控制型(Relaxedcontrol)：復(fù)制不受宿主細(xì)胞的調(diào)控，拷貝數(shù)高,適用于基因工程中做載體。分離質(zhì)粒DNA的方法堿變性法；煮沸法；SDS法；羥基磷灰石層析法等一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑（一）儀器1.恒溫?fù)u床2.超凈工作臺(tái)3.高壓滅菌鍋4.高速離心機(jī)5.微量取液器（二）材料

大腸桿菌JM109（pBR322-HBV）（三）試劑1.LB培養(yǎng)基2.LA培養(yǎng)基（LB+Amp）HBV片段pBR322-HBV四、實(shí)驗(yàn)步驟

甘油保存的菌種JM109-PBR322-HBV,涂布于LA瓊脂平板

37℃，培養(yǎng)過(guò)夜挑取單克隆于2mlLA液體培養(yǎng)基中37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜取1.4ml菌液入1.5ml的EP管中

12000rpm、離心30s，棄上清重復(fù)上述步驟一次100ul溶液I懸浮菌體（充分振蕩)加入200uL溶液II,顛倒混勻5次（輕柔），冰浴3～5min。棄上清，將Eppendorf管于吸水紙上倒置1min，室溫放置5min加40μlTE（pH8.0，含無(wú)DNA酶的RNA酶20μg/ml），溶解DNA，短暫混勻，室溫放置30min以消化RNA。取10μl進(jìn)行電泳，其余放置用于內(nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)，或-20℃貯存。

注意事項(xiàng)堿變性的時(shí)間嚴(yán)格控制酸中和的時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心取上清時(shí)，不要吸取中間的蛋白層漂洗沉淀時(shí)不要將沉淀沖掉溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖;25mmol/LTris-Cl(pH8.0);10mmol/LEDTA(pH8.0)(主要作用：SolutionI中的EDTA可以螯合二價(jià)金屬離子進(jìn)而抑制依賴于二價(jià)金屬離子的DNA酶的活性，對(duì)DNA起到保護(hù)作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌體。)溶液Ⅱ(pH12.6)0.2mol/LNaOH;1%SDS(現(xiàn)用現(xiàn)配)(主要作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性.SolutionII要新鮮配置,NaOH可吸收空氣中的二氧化碳而減弱堿性。加入solutionII后放置時(shí)間不要超過(guò)5min，以免變性質(zhì)粒不易復(fù)性)溶液Ⅲ(pH4.8)100ml5mol/LNaAc60