普通遺傳學(xué)基因工程和基因組學(xué)

普通遺傳學(xué)基因工程和基因組學(xué)第1頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五重組DNA技術(shù)第2頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)基因工程概述遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上：解釋、研究生物進化的原因、過程和規(guī)律(遺傳與進化)改善動、植物和微生物的遺傳特性——按照人類的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類型、新品種的人工進化過程(育種學(xué))。育種工作的理論和技術(shù)水平在很大程度上取決于遺傳學(xué)所取得的成就。迄今為止，動、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。第3頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五遺傳工程的基礎(chǔ)人類對自然改造的能力取決于對自然規(guī)律的認識水平。分子遺傳、生物化學(xué)及分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來自于：1.分子遺傳學(xué)的理論2.生物化學(xué)及分子生物學(xué)的理論與技術(shù)3.細胞生物學(xué)理論和技術(shù)第4頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五遺傳工程的含義生物技術(shù)生物工程：遺傳工程蛋白質(zhì)工程、酶工程微生物工程遺傳工程：在分子遺傳理論、技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過工程設(shè)計與施工方式，從細胞、分子水平改造生物遺傳特性作為一個綜合性的技術(shù)群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個：1.染色體工程2.細胞工程3.基因工程狹義的遺傳工程指的是基因工程第5頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

生物技術(shù)(biotechnology)

又稱生物工藝學(xué),生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營和開發(fā)微生物、動植物細胞及其亞細胞組分,進而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來提供商品或社會服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。第6頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

細胞工程(cellengineering)應(yīng)用細胞生物學(xué)的原理和方法,結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段,按照人們預(yù)先的設(shè)計,有計劃地改變或創(chuàng)造細胞遺傳性的技術(shù),以及在體外大量培養(yǎng)和繁殖細胞,或獲得細胞產(chǎn)品,或利用細胞體本身的技術(shù)領(lǐng)域。主要內(nèi)容包括細胞融合、細胞拆合、染色體轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移、細胞或組織培養(yǎng)等。由于所用細胞的來源不同，細胞工程又分為微生物細胞工程、植物細胞工程、動物細胞工程等。第7頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞工程第8頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五酶工程(enzymeengineering)又稱酶技術(shù)。它是圍繞著酶所特有的生化催化特性，結(jié)合現(xiàn)代的技術(shù)手段，在體外模擬或在常溫常壓下生成酶反應(yīng)的產(chǎn)品以及利用重組DNA技術(shù)定向改變酶，進行酶的修飾，或酶的全人工合成。其主要內(nèi)容包括酶的化學(xué)修飾、酶的固定化、酶反應(yīng)器等。第9頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)是更廣義上的包括酶工程在內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾操作，通過對蛋白質(zhì)及酶的化學(xué)修飾及基因改造獲得具有特殊功能的非天然蛋白質(zhì)的技術(shù)。主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系，利用基因工程技術(shù)，或用化學(xué)方法，合成基因,改造基因，以便合成新的蛋白質(zhì)，或改變蛋白質(zhì)的活性、功能以及溶解性等。第10頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五一、基因工程的概念（geneticengineering）1、定義：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細胞，使它們在受體細胞中增殖并表達的一種遺傳學(xué)操作。

2、目的:

生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳。第11頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀（分子水平上的操作）某一段DNA可在受體細胞內(nèi)進行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能（細胞水平上的表達）3、重要特征：第12頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五二、基因工程技術(shù)的誕生

1、基因工程的技術(shù)準(zhǔn)備基因工程技術(shù)的誕生不僅依賴于基因、分子生物學(xué)理論的發(fā)展，同時也有賴于一些重要的分子生物學(xué)研究方法的建立。最重要的技術(shù)準(zhǔn)備是限制性酶的分離純化、DNA連接酶的分離、大腸桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。到1970年，這三大技術(shù)都已經(jīng)建立，“萬事齊備，只欠東風(fēng)”了。到了1972～1973年，兩位科學(xué)助產(chǎn)士Berg和Cohen將基因工程接到了人間。第13頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五2、基因工程技術(shù)的誕生第14頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

第一個重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”

標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。第15頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第一個重組體構(gòu)建第16頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

第一個有功能重組體的構(gòu)建雖然Berg的工作具有劃時代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能。1973年，S.N.Cohen等在美國PNAS上發(fā)表了題為“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）的論文，宣布體外構(gòu)建的細菌質(zhì)粒能夠在細胞中進行表達,從而完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)。第17頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五三、基因工程技術(shù)路線1、DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）2、DNA片段和載體的連接——重組體DNA3、外源DNA片段引入受體細胞——基因克隆和基因文庫4、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，以擴增DNA重組分子，使其整合到受體細胞的基因組中5、目的基因表達分/合成切接轉(zhuǎn)增檢第18頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五體外操作與細胞內(nèi)表達第19頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1、DNA片段的獲得:從基因所在的生物體直接取得提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(genelibrary)，從中調(diào)用目的基因；

人工合成DNA片段（DNA合成儀）利用PCR（polymerasechainreaction）反應(yīng)特異性地擴增所需要的目的基因片段，mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（RT-PCR)用機械的方法:超聲波第20頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五首字母：大寫：細菌屬名2-3字母：小寫：細菌種名如EcoRⅠ4字母:大寫:菌株

Ⅰ，Ⅱ…:分離到的次序工具酶

限制酶（restrictionenzyme）：限制性內(nèi)切酶

Ⅰ類：限制和修飾作用

Ⅱ類：識別DNA內(nèi)部位點、切割雙鏈1、分類：根據(jù)酶結(jié)構(gòu)、作用及DNA結(jié)合和裂解的特性2、命名：第21頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第22頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

（2）產(chǎn)生平末端(bluntend):3、酶的識別和切割位點:通常4-6bp,具有回文結(jié)構(gòu)(palindrom)（1）產(chǎn)生粘性末端(stickingend)5＇-末端:EcoRⅠ:5＇-GAATTC-3＇

3＇-CTTAAG-5’3＇-末端:PstⅠ:5＇-CTGCAG-3＇

3＇-GACGTC-5＇

SmaⅠ:5＇-CCCGGG-3＇

3＇-GGGCCC-5＇第23頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五5、同尾酶(isoaudamers):

識別序列不同,但產(chǎn)生相同的粘性末端

BamHⅠ:GGATCC

Sau3AⅠ:NGATCN4、同功異源酶(isochizomers):

來源不同,識別和切割位點相同如:BamHⅠ和BstⅠ第24頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五限制性內(nèi)切酶限制酶第25頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五切割產(chǎn)生平齊末端（bluntends），如SmaI：第26頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五產(chǎn)生粘性末端（stickyends）：如BamHI、PstI：

識別特定堿基順序，如回文對稱序列（palindrome），又稱反向重復(fù)序列，從兩個方向閱讀其序列相同的序列。第27頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第28頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

大腸桿菌中第一個發(fā)現(xiàn)，MW109KD

方向：5＇3＇還具有5＇

3＇及3＇

5＇外切酶活性.

缺口平移法標(biāo)記DNA時常用修飾酶

對DNA或RNA末端進行剪切、補平、連接及化學(xué)修飾的酶。1、DNA聚合酶第29頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

方向：5＇

3＇作用：以RNA為模板合成DNA，構(gòu)建cDNA文庫2、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）將3＇-OH與5＇-P連接形成3＇,5＇-磷酸二酯鍵3、T4DNA連接酶（T4DNAligase）第30頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五4、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）6、TaqDNA聚合酶和其它耐熱DNA聚合酶

去除DNAorRNA5＇-P，制備載體時可防止載體自身連接，提高重組效率。5、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶：末端轉(zhuǎn)移酶作用：在DNA的3＇-OH上，加上dNTPPCR擴增第31頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)切酶、堿性磷酸酶、連接酶的作用第32頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。第33頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫的構(gòu)建

細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第34頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。第35頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

基因文庫的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，便構(gòu)成了該生物的基因文庫。第36頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。加入4種物質(zhì)：

（1）作為模板的DNA序列；

（2）與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補的DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。第37頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五PCR的基本反應(yīng)步驟：1、變性：將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈；2、退火：將溫度下降至50℃左右，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3、延伸：將溫度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng)25～30次循環(huán)后，可將模板DNA擴增達百萬倍。第38頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個基因片段第39頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五PCR儀離心機第40頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五GenomeDNATotalRNA第41頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問題——

費時費事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA方法的優(yōu)勢——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因第42頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五2、DNA片段和載體的連接—重組體DNA載體：細菌中的質(zhì)粒、溫和噬菌體重組體DNA：載體DNA+引入的DNA粘性末端平整末端連接酶第43頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第44頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第45頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五載體（vector）：將“目的”基因?qū)胧荏w細胞的運載工具。DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體等。DNA片段+適合的載體DNA重組DNA，在載體DNA的運載下，高效率地進入宿主細胞，并在其中進行復(fù)制。第46頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五①具有復(fù)制原點，能自我復(fù)制；②具多克隆位點(multiplecloningsite，MCS或polylinkerregion)，即有多種限制酶的切點；③選擇時的遺傳標(biāo)記，如抗生素基因；④易從宿主細胞中回收。載體的條件：第47頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1．該質(zhì)粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。2．進入宿主細菌細胞后，pUC18在每個細胞中可復(fù)制形成大約500個拷貝。3．在pUC18中有一小段人為設(shè)計和插入的具有多種限制性酶切位點的序列，即多克隆位點

細菌質(zhì)粒pUC18第48頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

pUC18質(zhì)粒的多克隆位點整合在lacZ基因中，該位點如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達出-半乳糖苷酶，如果平板培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal，X-gal便會被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍色克隆。在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成白色的克隆。4．利用lacZ基因的插入失活篩選重組質(zhì)粒5．pUC18還攜帶了氨卞青霉素抗性基因，可篩選重組質(zhì)粒。第49頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五λ噬菌體

◆

λ噬菌體基因組全長49kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細菌及形成噬菌斑的能力?！籀耸删w載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達載體，在基因庫篩選中，λ噬菌體作載體與細菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽性克隆數(shù)多等特點，現(xiàn)廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。

第50頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五柯斯質(zhì)粒

◆柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的?？滤官|(zhì)粒具有λ噬菌體的cos序列(12bp)和細菌質(zhì)粒的復(fù)制原點?？滤官|(zhì)粒也具有抗生素抗性基因◆可接受長達50kb的外源DNA片段，這在克隆真核生物基因中十分有用，因為一個DNA片段就可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。還與YAC克隆系統(tǒng)結(jié)合，用于基因作圖分析。

第51頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五穿梭載體

穿梭載體(shuttlevectors)是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細胞(如酵母)中復(fù)制的載體。因此，這類載體不僅具有細菌質(zhì)粒的復(fù)制原點及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點。通常穿梭載體在細菌中用于克隆、擴增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達分析。

第52頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五BAC載體是基于細菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點構(gòu)建的。F因子是細菌細胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒，約100kb，它能在細菌接合時轉(zhuǎn)移1000kb的細菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。帶有外源片段的BAC載體在細菌細胞中通常僅單個拷貝，這一特點有利于保持DNA大分子，尤其是重復(fù)序列多的DNA大分子，在細胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，如由小F質(zhì)粒構(gòu)建的載體pBeloBAC11全長7.4kb，僅帶有自我復(fù)制、控制拷貝數(shù)(repE)及質(zhì)粒分配(parE，parA,parB)所必須的最少序列。BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點。在多克隆位點兩側(cè)，還有T7及SP6啟動子位點，用于制備RNA分子，進一步分析克隆的基因表達，作為染色體步行的探針，以及序列測定克隆的片段。細菌人工染色體第53頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五細菌人工染色體第54頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

酵母人工染色體◆酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）是另一類酵母穿梭載體。同Yep載體一樣具有自主復(fù)制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。

第55頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五Ti質(zhì)粒及其衍生載體

第56頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五◆

Ti質(zhì)粒具有五個主要功能區(qū)域，它們分別是T-DNA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移(plasmidtransfer)、冠癭堿代謝(opinecatabolism)、復(fù)制原點(ori)和毒性區(qū)域(vir)?！?/p>

T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的序列，僅是T-DNA兩端與其它序列交界處的25bp不完全直接重復(fù)(imperfectdirectrepeats)，右端的序列稱為右界(rightborder,RB),左端的為左界(leftborder,LB)。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。◆

Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的。

Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難用作DNA克隆載體進行操作.

Ti質(zhì)粒特點第57頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五3、重組體DNA引入受體細胞受體:大腸桿菌、真核細胞轉(zhuǎn)基因生物（transgenicanimals）：接受了外源基因，發(fā)生了性狀改變的生物克?。╟lones）、無性繁殖系:基因文庫（genelibrary）第58頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第59頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫。根據(jù)克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等?；蛭膸欤╨ibrary）：第60頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

以大腸桿菌為宿主菌進行基因的克隆將目的基因克隆到大腸桿菌細胞中的操作步驟：1．獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2．形成重組質(zhì)粒；3．制備感受態(tài)細胞，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；4．培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝；5．篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細胞，進行檢查或鑒定。第61頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

基因組DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)， 由克隆載體所攜帶的所 有基因組DNA的集合。 簡稱G－文庫。第62頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

cDNA文庫

用細胞總mRNA

制備全套雙鏈cDNA后， 建立的基因文庫。簡稱

c－文庫。

第63頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

一般克隆基因的檢查和鑒定方法

瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅(qū)動力和凝膠阻力

——不同遷移率分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物

酶切和電泳方法第64頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五32P標(biāo)記的DNA分子探針雜交放射自顯影法

DNA雜交直接鑒定第65頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五4、選擇基因(轉(zhuǎn)化受體細胞和轉(zhuǎn)化子的篩選)核酸分子雜交（molecularhybridization）：遺傳學(xué)方法：篩選轉(zhuǎn)化菌；α互補免疫學(xué)方法：蛋白質(zhì)原位分子雜交：PCR方法：探針（probes）:根據(jù)所需基因的核苷酸順序制成一段與之互補的核苷酸短鏈，并用同位素標(biāo)記。第66頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第67頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

是southern于1975年創(chuàng)建用以鑒定DNA中某一特定的基因片段的技術(shù)，也稱為Southern印跡（SouthernBlot）。通過標(biāo)記的探針DNA與靶DNA結(jié)合，檢測目的基因的存在及大小。Southern雜交第68頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五Northern雜交

也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達量。因與DNA的雜交（Southern雜交）相對應(yīng)，故被趣稱為Northern雜交。第69頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五原位雜交細胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。

細菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。第70頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五Western(印跡)雜交

蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達量。與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對應(yīng)，稱為Western雜交。常結(jié)合Northern印跡技術(shù)，檢測基因表達調(diào)控。第71頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五Southernblottingwesternblotting第72頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五SDSPCR檢測第73頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五5、目的基因的表達

目的基因在插入載體后，在其編碼順序的5’端有能被受體細胞識別的啟動基因順序及能和核糖體結(jié)合的順序。則該目的基因就可以表達，從而使基因工程得以實現(xiàn)。第74頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五基因工程的技術(shù)組合第75頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第76頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五四、基因工程的基礎(chǔ)與應(yīng)用第77頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積年份19961997199819992000面積1701100278039904420年份2001200220032005面積5260587081109000（單位:公頃）第78頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五4種主要轉(zhuǎn)基因作物種植情況（2005年）

作物

大豆

棉花

油菜

玉米面積（公頃）54409804602120占同類作物%60%28%18%14%第79頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五改變花色的轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǖ?0頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)入熒光素酶蛋白基因的發(fā)熒光煙草第81頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)基因甜椒第82頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)基因西紅柿第83頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五藍色玫瑰一直是人類美麗的夢想基因工程正在將它變?yōu)楝F(xiàn)實第84頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。第85頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)基因組學(xué)Genomics第86頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五基因組學(xué)（genomics）這一名詞是美國人T·H·Rodehck在1986年7月創(chuàng)造出來的，與一個新的雜志genomics一道問世?；蚪M學(xué)完全改變只能研究單個基因的狀況，它著眼于研究并解析生物體整個基因組的所有遺傳信息?；蚪M學(xué)就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能的科學(xué)。一、基因組學(xué)的概念及范疇第87頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五基因組學(xué)包括3個不同的亞領(lǐng)域：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)功能基因組學(xué)(functionalgenomics)比較基因組學(xué)(comparativegenomics)基因組學(xué)概念第88頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五二、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)是通過人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)的實施來完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。第89頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

二十世紀(jì)人類的“三大計劃”曼哈頓原子彈計劃阿波羅登月計劃人類基因組計劃第90頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五曼哈頓原子彈計劃第91頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

我國進行的氫彈實驗第92頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五阿波羅登月計劃第93頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五宇航員登上阿波羅飛船第94頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五阿波羅飛船外形第95頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第96頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五月球車第97頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組計劃HGP也稱人類基因測序計劃，主要目標(biāo)是完成對人的基因組的所有堿基序列的測定，闡明人體中全部基因的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達、調(diào)控方式及致病突變的全部信息?；救蝿?wù)是完成遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。人類基因組包括24條染色體，3×109bp，3-4萬個基因。第98頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1986年，美國杜伯克在《科學(xué)》上撰文，號召大家聯(lián)合起來，從整體上把人類的基因組搞清。

1990年10月，經(jīng)5年的辯論以后，美國國會終于批準(zhǔn)被譽為生命科學(xué)“阿波羅登月計劃”的國際人類基因組計劃。第99頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組計劃的目標(biāo)人類基因組計劃是一項國際性的研究計劃。它的目標(biāo)是通過以美國為主的全球性的國際合作，在大約15年的時間里完成人類24條染色體的基因組作圖和DNA全長序列分析，進行基因的鑒定和功能分析。人類基因組計劃的“科學(xué)產(chǎn)品”將是一個人類遺傳信息數(shù)據(jù)庫，將是一本指導(dǎo)人類進化的“說明書”。人類基因組計劃的最終目標(biāo)就是確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，并確定、闡明和記錄組成的人類基因組的全部DNA序列。第100頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五與人類登月計劃相比，HGP的資金投入少，但它對人類生活的影響都可能更深遠。隨著這個計劃的完成，DNA分子中儲藏約有關(guān)人類生存和繁衍的全部遺傳信息將被破譯，它將幫助我們理解人類如何作為健康人發(fā)揮正常生理功能，還將最終揭示嚴(yán)重危害人類健康疾病的機理。第101頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1、HGP的主要任務(wù)遺傳圖譜物理圖譜序列圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜第102頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五遺傳圖譜（geneticmap）又稱連鎖圖譜(linkagemap)，它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個位點之間進行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。遺傳圖譜的建立為基因識別和完成基因定位創(chuàng)造了條件。遺傳圖譜-孟德爾的“新生”

第103頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五遺傳作圖：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。遺傳圖距單位為厘摩（cM）。遺傳圖有特征性的位置標(biāo)記用于表示基因組中特定順序所在的位置。遺傳作圖的標(biāo)記有基因標(biāo)記和DNA標(biāo)記兩類。第104頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人基因組全長約3300cM，如兩個標(biāo)記之間相距1cM，則需3300個標(biāo)記，如相距2～5cM，則需660～l650個標(biāo)記。標(biāo)記可以是體質(zhì)性狀，也可以是可檢出的DNA序列，例如基因、限制片段長度多態(tài)性（RFLP）和特定的單一序列等。每一個標(biāo)記都要用專一序列位點（STS）作鑒定。STS是指其位置及核苷酸序列均已知的、人基因組中只有一份拷貝的DNA短片段（一般長200～500堿基對）?？捎肧TS來確定這些DNA片段的定位與取向。第105頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五DNA遺傳標(biāo)記1、RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)。DNA序列上的微小變化，可能引起限制性內(nèi)切酶切點的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長度的變化。第106頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第107頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第108頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

SSLP是一些長度不等的重復(fù)序列、有多個等位基因位點。多次重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTR)：也稱微隨體(minisatellite)，重復(fù)序列長度為幾十個核苷酸。簡單重復(fù)序列(simpletandemrepeats，STRs)：又稱為小隨體(microsatellite)，常只有2~4個核苷酸重復(fù)單位。利用STR作為標(biāo)記更為普遍：

STR分布在整個基因組中，而VNTR主要集中在染色體末端；

STR的PCR檢測速度更快、準(zhǔn)確性更高，因為STR長度通常在300bp以下，而VNTR相反。2、簡單序列長度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymor-phisms，SSLP)：第109頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五3、單核苷酸的多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）SNP：是由于單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)。第一軍醫(yī)大學(xué)2003年分子生物學(xué)

第110頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五基因組合中單個核苷酸的突變稱為點突變，理論上每個核苷酸位置最多只有4種形式，即A,T,C,G。某些群體在特定的單核苷酸位置只有2個或3個SNP，這些位點稱為雙等位（biallele）或三等位（triallele）。據(jù)估計，人類基因組中位于基因內(nèi)部的SNP超過200000，基因外部的點突變是基因內(nèi)部的10倍，總數(shù)在3000000左右。第111頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

家系分析法：分析8個家系134個成員（186個減數(shù)分裂），根據(jù)5264個STR(簡單重復(fù)序列)標(biāo)記繪制而成。（X染色體分析是利用12家系170個成員（105個減數(shù)分裂））。將5264個標(biāo)記定位在2335個位點，構(gòu)建的人類基因組遺傳圖譜密度為每個標(biāo)記599kb。人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建：第112頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五物理圖譜（physicalmap）是指有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過對構(gòu)成基因組的DNA分子進行測定而繪制的。物理作圖：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組合實際位置。繪制物理圖譜的目的是把有關(guān)基因的遺傳信息及其在每條染色體上的相對位置線性而系統(tǒng)地排列出來。物理圖-路標(biāo)與路軌第113頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五限制性作圖：是將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置。依靠克隆的基因組作圖：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群，繪制物理連鎖圖。熒光標(biāo)記原為雜交：將熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交確定分子標(biāo)記所在位置。順序標(biāo)簽為點左圖：通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組DNA區(qū)段中。物理作圖的方法有4類：第114頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組的物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列標(biāo)簽位點，sequence-taggedsite,STS)為“路標(biāo)”，以堿基對(bp，kb，Mb)作為基本測量單位(圖距)的基因組圖。STS是基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。得到5套以上包含相關(guān)染色體或整個基因組的DNA片段是建立STS物理圖的先決條件。然后，可以通過拼接而得STS物理圖。第115頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五當(dāng)2個片段含有同一STS順序時，可以確認這2個片段彼此重疊。兩個STS標(biāo)簽在基因組上靠得近，它們就會一致同時出現(xiàn)在DNA大片段上；兩個STS標(biāo)簽在基因組上相距較遠，它們同時出現(xiàn)在一個DNA大片段上的幾率就會小得多。物理圖的主要內(nèi)容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。只要有一定數(shù)量的STS標(biāo)簽，所有DNA大片段在該染色體或基因組中的位置都能被確定。第116頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五第117頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類部分染色體物理圖譜第118頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

以EST（expressedsequencetag，表達序列標(biāo)簽）為標(biāo)記，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。EST：通過從cDNA文庫中隨機挑選的克隆進行測序所獲得的部分cDNA的5'或3'端序列稱為表達序列標(biāo)簽（EST），一般長300-500bp左右。轉(zhuǎn)錄圖-生命的樂譜第119頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

對基因轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物mRNA互補的cDNA（其片段稱為表達序列標(biāo)簽，EST）進行大規(guī)模測序是序列標(biāo)簽位點的主要來源，并以此構(gòu)建人類基因組轉(zhuǎn)錄圖（基因圖）。第120頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五獲得各類組織或細胞的基因表達譜，從而給出人體200余種基本組織或不同細胞組成的人體基因圖(bodymap)。轉(zhuǎn)錄圖（基因表達譜）研究所提供的信息，使人們有可能系統(tǒng)地全面地從mRNA水平了解特定細胞、組織或器官的基因表達模式并解釋其生理屬性，深入認識細胞生長、發(fā)育、分化、衰老和疾病發(fā)生的機制。第121頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組的序列圖-重中之重人類基因組的核苷酸序列圖(humangenomesequence)是分子水平上最高層次的、最詳盡的物理圖。測定總長約lm、由30億個核苷酸組成的全序列。人類所擁有的基因位點都是相同的，不同種族、不同個體的基因差異(人類基因組的多樣性)以及“正?！迸c“疾病”基因的差異，只是同一位點上的等位基因的差異。第122頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組與其他動物基因組在染色體水平上有“共線”(即同源)現(xiàn)象。人類第21號染色體HSA21位點與小鼠第16號染色體MMUl6，MMUl7和MMUl0連鎖圖的比較，兩者之間存在著廣泛的同源性。人類基因組計劃所提供的人類核酸序列圖，蘊藏了決定我們生、老、病、死的所有遺傳信息，將成為人類認識自我、改造自我－使人類健康長壽的知識源泉，為21世紀(jì)現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奠定了基礎(chǔ)。第123頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五3、大規(guī)模基因組測序

Megabace測序儀3700測序儀第124頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五大規(guī)模測序基本策略逐個克隆法：對連續(xù)克隆系中排定的BAC克隆逐個進行亞克隆測序并進行組裝（公共領(lǐng)域測序計劃）全基因組鳥槍法：在一定作圖信息基礎(chǔ)上，繞過大片段連續(xù)克隆系的構(gòu)建而直接將基因組分解成小片段隨機測序，利用超級計算機進行組裝（美國Celera公司）第125頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五運用計算機軟件進行序列拼接第126頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類單倍體基因組含30億堿基對(bp)的DNA序列。編碼序列約占3%，非編碼序列約占97%。包括約4～10萬個基因，分布于22條常染色體和X、Y性染色體。第127頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五5、我國對人類基因組計劃的貢獻1994年，我國HGP在吳旻、強伯勤、陳竺、楊煥明的倡導(dǎo)下啟動，最初由國家自然科學(xué)基金會和863高科技計劃的支持下，先后啟動了“中華民族基因組中若干位點基因結(jié)構(gòu)的研究”和“重大疾病相關(guān)基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)和功能研究”；1998年在國家科技部的領(lǐng)導(dǎo)和牽線下，1998年在上海成立了南方基因中心；1999年在北京成立了北方人類基因組中心；1999年7月在國際人類基因組注冊，得到完成人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序任務(wù)，該區(qū)域約占人類整個基因組的1％。第128頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五6、HGP進展與未來整個完成的時間提前到了2003年，比原計劃提前了兩年。而原訂于2001年完成的人類基因組的基本構(gòu)圖也提前一年，在2000年6月26日由美國總統(tǒng)克林頓與英國首相布萊爾聯(lián)合宣布完成，這一天也因此成為人類歷史上“值得載入史冊的一天”。后基因組計劃，即功能基因組計劃的開始。第129頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五2000年2000年6月26日，美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯·柯林斯、塞萊拉公司的董事長兼首席科學(xué)家克萊格·文特爾、美國總統(tǒng)克林頓、英國首相布萊爾聯(lián)合宣布人類基因組工作草圖繪制成功。此后，人類基因組研究進入繪制“完成圖”的階段。與“框架圖”相比，“完成圖”的覆蓋率從90％擴展到100％，準(zhǔn)確率從99％上升到99.99％。第130頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因組草圖基本信息由31.65億bp組成含3~3.5萬基因與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源第131頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五2001年2001年2月12日，參加繪制人類基因組圖譜的美、英、日、法、德、中6國科學(xué)家公布了更加準(zhǔn)確、清晰、完整的人類基因組圖譜，并指出人類基因總數(shù)只有3~3.5萬個,編碼序列占2%。2001年7月10日，中國“人類基因組計劃”重大項目秘書長楊煥明教授宣布：在人類基因組完成圖的繪制工作中，中國已率先超額（1.13%）完成所承擔(dān)的任務(wù)。第132頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五2003年4月14日，6國科學(xué)家宣布人類基因組序列圖繪制成功，HGP的所有目標(biāo)全部實現(xiàn)。覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域的99%，精確率達到99.99%，比原計劃提前兩年多，耗資27億美元。并公開研究數(shù)據(jù)和結(jié)果，贏得了這場競賽。2003年第133頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1、人類基因組中只有1%是編碼序列。2、外顯子只約占每條基因的5%，因此基因組中只有25%的序列是來自基因的外顯子加內(nèi)含子。3、人類基因組只有30000-40000條基因。4、約60%的人類基因是可變剪接的。5、多達80%的可變剪接改變了蛋白質(zhì)序列，因此蛋白質(zhì)組約有50000-60000個蛋白質(zhì)成員。6、重復(fù)序列占人類基因的50%。人類基因組測序結(jié)果顯示：第134頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五人類基因的平均長度為22kb，平均有9個外顯子，而這9個外顯子總共約長1340bp，因此，編碼序列平均只占基因長度的5%。因為存在可變剪接，所以基因的總數(shù)比潛在的蛋白質(zhì)數(shù)目少。人類和黑猩猩在DNA序列上相差非常?。ㄐ蛄邢嗨菩源笥?9%），因此，雖然基因極其相似，但它們的功能和一組相似基因的相互作用顯然能夠產(chǎn)生極不相同的結(jié)果。第135頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

水稻的基因組

2002年4月5日我國科學(xué)家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意料的是，水稻的基因竟比人類基因還要多得多。人類基因大約有3-4萬個，水稻有46022-55615個基因。因此水稻基因組可說是繼人類基因組之后，完成定序的最大基因組，也是至今已知最大的植物基因組。由于水稻是全球半數(shù)以上人口的主食，對解決全球糧食問題具有重要意義。第136頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五

由于以人類為對象的研究實際上受到諸多限制，也受倫理學(xué)的約束，所以人類基因組計劃還將對有關(guān)的模式生物，如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、擬南芥等進行研究，為人類的基因組研究提供重要的依據(jù)。模式生物基因組研究第137頁，共157頁，2023年，2月20日，星期五1996年，完成酵母菌基因組測序。19