(1.26)-10-2囊泡運(yùn)輸調(diào)控生理學(xué)課件

囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)2013年10月7日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎評審委員會將本年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎聯(lián)合授予美國耶魯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系主任JamesE.Ｒothman、加利福尼亞大學(xué)伯克利分校細(xì)胞生物學(xué)家ＲandyW．Schekman和德國生物學(xué)學(xué)家斯坦福大學(xué)教授ThomasC.Südhof，以表彰他們在細(xì)胞內(nèi)主要運(yùn)輸系統(tǒng)方面所作的杰出貢獻(xiàn)。囊泡運(yùn)輸是一個生命活動的基本過程，又是一個極其復(fù)雜的動態(tài)過程，包括出芽、錨定和融合等過程，即囊泡的形成、傳遞和融合過程。這一過程需要蛋白質(zhì)分子、運(yùn)輸復(fù)合體、動力蛋白和微管以及調(diào)控因子等的參與，才能使細(xì)胞有條不紊的進(jìn)行正常的生命活動。1、問題的提出早在20世紀(jì)70年代，帕拉德（GeorgePalade，1974年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）等結(jié)合形態(tài)學(xué)和細(xì)胞組分分離方法觀察到細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器間存在蛋白運(yùn)輸，如分泌蛋白需要首先進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后通過高爾基體加工后分泌到細(xì)胞外，顯微鏡下觀察到該過程由一種被稱為囊泡的結(jié)構(gòu)介導(dǎo)完成。借助顯微鏡，研究人員對囊泡運(yùn)輸進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)囊泡可從一個膜上出芽或剪切，然后運(yùn)輸?shù)搅硪荒ぬ幣c其結(jié)合或融合，多種類型的囊泡有序往返，將所包含的蛋白“貨物”精確運(yùn)輸?shù)秸_位置。但當(dāng)時的研究僅停留在形態(tài)描述上，對分子機(jī)制涉及較少，許多重要問題并未解決，如囊泡如何從膜上出芽、囊泡如何確定“貨物”去處，以及如何實(shí)現(xiàn)與靶膜（而不是其他膜）的特異性融合等。這些問題引起了許多科學(xué)家的關(guān)注包括謝克曼和羅斯曼，他們決定首先鑒別出囊泡運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)分子。2、囊泡運(yùn)輸基因鑒定1975年，謝克曼從斯坦福大學(xué)獲得博士學(xué)位，導(dǎo)師是科恩伯格（ArthurKornberg，1959年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者），謝克曼重點(diǎn)研究細(xì)菌DNA復(fù)制機(jī)制，并掌握了低等生物實(shí)驗(yàn)操作方法。畢業(yè)后，謝克曼進(jìn)入加州大學(xué)圣地亞哥分校跟隨辛格（SeymourJonathanSinger，生物膜流體鑲嵌模型提出者）研究膜結(jié)構(gòu)，不久謝克曼發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞過于復(fù)雜，因此決定尋找新的模式細(xì)胞進(jìn)行研究。當(dāng)時，哈特韋爾（LelandHarrisonHartwell，2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）以酵母為材料研究細(xì)胞周期取得了重大突破，這給予謝克曼極大信心，他決定選擇大多數(shù)科學(xué)家都認(rèn)為不適合研究分泌機(jī)制的酵母細(xì)胞作為材料。1976年，謝克曼成為加州大學(xué)伯克利分校助理教授，他開始運(yùn)用遺傳學(xué)方法尋找酵母細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸相關(guān)分子。謝克曼和助手首先利用顯微鏡和細(xì)胞化學(xué)染色方法，觀察到酵母內(nèi)存在與哺乳動物細(xì)胞類似的囊泡結(jié)構(gòu)，并推測這些囊泡對于酵母細(xì)胞內(nèi)酶的運(yùn)輸具有重要意義，因此運(yùn)輸受阻將影響酵母生存。謝克曼和他的學(xué)生諾維克（PeterNovick）篩選到大量溫度敏感型酵母突變體，這些突變體在低溫下可正常生存；但溫度升高后可造成酵母死亡。謝克曼從中檢測到2株突變體，原本應(yīng)分泌到胞外的酶卻滯留于酵母體內(nèi)同時酵母體內(nèi)積累了大量未分泌囊泡（圖1）。謝克曼將這些突變造成酵母囊泡運(yùn)輸遺傳的基因命名為“分泌基因”，而這2個基因首先確定為sec1和sec2。謝克曼和學(xué)生對酵母突變體進(jìn)行大規(guī)模篩選，最終獲得23個參與蛋白質(zhì)分泌的基因，根據(jù)它們作用途徑（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或其他）的差異而將其分為3類。遺傳和生化分析進(jìn)一步顯示酵母中的囊泡運(yùn)輸在哺乳動物中也普遍適用。謝克曼利用酵母遺傳學(xué)分析所獲得23個分泌基因（sec1~sec23）開創(chuàng)了囊泡運(yùn)輸分子機(jī)制研究的新領(lǐng)域，這些分子的生物學(xué)功能的后續(xù)鑒定成為許多研究人員的重要任務(wù)，而與此同時，羅斯曼利用生物化學(xué)方法的研究囊泡運(yùn)輸也取得了重大突破。3、囊泡運(yùn)輸?shù)纳锘瘜W(xué)研究羅斯曼最早對物理學(xué)有著濃厚興趣，然而在耶魯大學(xué)期間卻被生物學(xué)深深吸引，尤其是膜生物學(xué)。1971年獲得物理學(xué)學(xué)士后，羅斯曼進(jìn)入哈佛醫(yī)學(xué)院，跟隨著名膜生物學(xué)家肯尼迪（EugenePatrickKennedy）學(xué)習(xí)膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，在隨后2年的博士后學(xué)習(xí)中熟練掌握了利用無細(xì)胞體系研究生物學(xué)問題的方法。1978年，羅斯曼受科恩伯格的影響加入斯坦福大學(xué)生物化學(xué)系，在這里羅斯曼又掌握了2條基本原則，一是學(xué)會制定用生物化學(xué)方法解決復(fù)雜生物學(xué)問題的策略；二是生物化學(xué)方法是解決和解釋復(fù)雜生物學(xué)問題的唯一可靠方式。正因?yàn)閳孕派锘瘜W(xué)方法的有效性，羅斯曼決定用該方法研究囊泡運(yùn)輸。羅斯曼研究的基本策略為：首先將哺乳動物細(xì)胞破碎獲得無細(xì)胞體系，從中分離出蛋白運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)組分，然后在試管內(nèi)通過分析這些組分缺失對蛋白運(yùn)輸?shù)挠绊憦亩_定其生物學(xué)功能。這種策略為經(jīng)典生物化學(xué)方法，在ATP合成、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和遺傳密碼破譯等研究中顯示出巨大優(yōu)勢，但卻遭到了許多科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認(rèn)為囊泡運(yùn)輸依賴于空間位置，而體外無細(xì)胞體系會不可避免地破壞囊泡間的空間聯(lián)系，根本無法完成蛋白運(yùn)輸。羅斯曼根據(jù)部分蛋白在運(yùn)輸過程中需要糖基化修飾這個原理，創(chuàng)造性地設(shè)計出一個檢測蛋白運(yùn)輸相關(guān)元件的無細(xì)胞試管體系。羅斯曼獲得2份勻漿，一份含G蛋白（需修飾）但缺乏高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶；另一份缺乏G蛋白但擁有高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶。2份勻漿在單獨(dú)狀態(tài)下都無法完成G蛋白運(yùn)輸，然而混合后卻實(shí)現(xiàn)了G蛋白的正確定位，這意味著囊泡運(yùn)輸由內(nèi)部化學(xué)特異性決定，而非空間位置。無細(xì)胞體系在囊泡運(yùn)輸研究中被確認(rèn)有效性，極大推進(jìn)了后續(xù)相關(guān)分子的鑒定成功。4、囊泡形成機(jī)制的闡明利用無細(xì)胞體系，羅斯曼和他的學(xué)生重點(diǎn)研究高爾基體之間的蛋白運(yùn)輸，首先確定了囊泡形成（出芽）的3個基本要素：一是高爾基體膜；二是囊泡形成和分離過程中的背膜結(jié)構(gòu)；三是能量分子GTP。為確定囊泡形成的相關(guān)分子，羅斯曼用無法水解的GTP類似物GTPγS處理無細(xì)胞體系造成囊泡出芽障礙，從而積累大量背膜。羅斯曼純化了背膜并分析其組成，確定這是一種7亞基復(fù)合物，稱為背膜蛋白復(fù)合物Ⅰ（CoatProteinComplexⅠ，COPⅠ），其主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向和反向及高爾基體之間的蛋白運(yùn)輸。后來，又相繼鑒定出另外2類背膜，一類是網(wǎng)格蛋白（clathrin）型背膜，主要參與高爾基體到質(zhì)膜的蛋白運(yùn)輸；另一類是COPⅡ，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向蛋白運(yùn)輸。羅斯曼小組還確定了一種GTP結(jié)合蛋白———ADP核糖基化因子（ADPribosylationfactor，ARF），該因子是囊泡形成的必需因素，從而解釋了GTP參與囊泡形成的作用。至此，羅斯曼提出了囊泡形成（出芽）的分子機(jī)制：攜帶GTP的ARF在高爾基體表面通過招募7亞基至高爾基體表面而啟動囊泡出芽，當(dāng)形成完整囊泡后，利用GTP水解供能使囊泡與高爾基體分離。與此同時，謝克曼研究了酵母細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運(yùn)輸過程，發(fā)現(xiàn)也形成了類似哺乳動物細(xì)胞的背膜結(jié)構(gòu)，盡管酵母的亞基組成與哺乳動物不同，但背膜形成和分離過程中也需要GTP結(jié)合蛋白參與，且基本過程機(jī)制類似。GTP酶結(jié)合蛋白啟動的背膜復(fù)合物形成及囊泡分離有效解釋了囊泡形成機(jī)制，隨后囊泡運(yùn)輸?shù)陌邢蛉诤蠙C(jī)制成為亟待解決的關(guān)鍵問題。5、囊泡融合過程的闡述1987年，羅斯曼的學(xué)生發(fā)現(xiàn)N-乙酰馬來酰胺（N-ethylmaleimide，NEM）可有效阻斷無細(xì)胞體系內(nèi)的蛋白運(yùn)輸，隨后將NEM敏感因子（NEM-sensitivefactor，NSF）進(jìn)行了純化。NSF定位于細(xì)胞質(zhì)，是一個多亞基復(fù)合物，它的缺乏不影響高爾基體囊泡出芽，但會破壞囊泡融合。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，NSF能與可溶性NSF附著蛋白（solubleNSFattachmentproteinSNAP）結(jié)合形成復(fù)合物并被引導(dǎo)至靶膜。1993年，羅斯曼利用親和純化方法從牛腦中分離得到SNAP受體（SNAPreceptor，SNARE）,SNARE是一種主要由α-螺旋形成的單跨膜蛋白，在囊泡和靶膜（targetmembrane）上均存在，分別稱為v-SNARE和t-SNARE。細(xì)胞內(nèi)存在多種SNARE，羅斯曼據(jù)此提出囊泡融合的SNARE假說，該假說認(rèn)為，只有當(dāng)v-SNARE和t-SNARE兩者特異性識別才可形成拉鏈狀的SNARE復(fù)合物，從而促進(jìn)靠近的囊泡和靶膜實(shí)現(xiàn)融合（圖2）。v-SNARE在出芽過程中被整合入囊泡，隨后攜帶v-SNARE囊泡只與表達(dá)對應(yīng)t-SNARE靶膜融合，從而保證了蛋白運(yùn)輸?shù)陌邢騿栴}。與此同時，羅斯曼利用酵母研究囊泡融合過程，深入分析表明酵母sec18與哺乳動物NSF編碼基因同源，而SNAP基因則與酵母sec17同源；此外，酵母sec17和sec18基因產(chǎn)物也發(fā)揮了類似哺乳動物NSF和SNAP的作用，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的生物采用類似機(jī)制進(jìn)行囊泡融合說明了該過程的進(jìn)化保守性。6、神經(jīng)遞質(zhì)釋放的鈣離子調(diào)節(jié)機(jī)制神經(jīng)元間突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常完成的基本方式，其中化學(xué)性突觸傳遞涉及突觸小泡的胞內(nèi)生成、運(yùn)輸及與細(xì)胞膜的融合，最終將神經(jīng)遞質(zhì)分泌到胞外，從而完成神經(jīng)元的胞吐作用（exocytosis）。已知鈣離子控制神經(jīng)元胞吐過程，但對其詳細(xì)機(jī)制缺乏深入理解，蘇德霍夫?qū)Υ诉M(jìn)行了深入探索。1982年，蘇德霍夫從哥廷根大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)學(xué)位，同年還從馬普研究所獲得博士學(xué)位。1983年，蘇德霍夫來到美國德克薩斯州西南大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，在布朗（MichaelStuartBrown，1985年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）和戈?duì)柎奶梗↗osephLeonardGoldstein，1985年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者）的指導(dǎo)下研究低密度脂蛋白受體在膽固醇代謝中的作用。1986年，蘇德霍夫成為霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員和西南醫(yī)學(xué)中心員工，開始了對突觸前神經(jīng)元的研究。1988年，施勒（RichardH.Scheller）分離得到囊泡相關(guān)膜蛋白（vesicle-associatedmembraneprotein，VAMP），次年，蘇德霍夫從大鼠大腦中分離出了相同蛋白，將其命名為小突觸泡蛋白（synaptobrevin）。不久，施勒又發(fā)現(xiàn)另一種定位于細(xì)胞膜上的突觸融合蛋白（syntaxin）。與此同時，羅斯曼在大腦中尋找SNAP受體，從而鑒定出3種蛋白VAMP/synaptobrevin、突觸融合蛋白和突觸小體相關(guān)蛋白-25（synaptosomal-associatedprotein25，SNAP-25），進(jìn)一步證實(shí)了定位于囊泡的VAMP/synaptobrevin為v-SNARE，而定位于神經(jīng)末端細(xì)胞膜的syntaxin和SNAP-25共同構(gòu)成t-SNARE，三者形成復(fù)合物促使囊泡與細(xì)胞膜融合，從而明確了突觸膜融合的分子機(jī)制。1990年，蘇德霍夫純化出另一種囊泡蛋白—突觸結(jié)合蛋白（synaptotagmin），并確定這種蛋白也與囊泡融合相關(guān)。蘇德霍夫還發(fā)現(xiàn)鈣離子可促使突觸結(jié)合蛋白與磷脂結(jié)合。突觸結(jié)合蛋白是一類進(jìn)化上比較保守的單跨膜囊泡蛋白，C端擁有2個鈣離子結(jié)合域（C2A和C2B），可作為鈣離子傳感器發(fā)揮作用，小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)突觸結(jié)合蛋白主要在囊泡融合后神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮作用。這一系列結(jié)果確定突觸結(jié)合蛋白是鈣離子的作用位點(diǎn)，神經(jīng)細(xì)胞鈣離子外流可通過激活突觸結(jié)合蛋白而招募相關(guān)分子到融合處，隨后突觸小泡與神經(jīng)細(xì)胞膜融合，并促使小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放到神經(jīng)細(xì)胞（圖3）。蘇德霍夫還進(jìn)一步明確了鈣離子更為精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制。1995年，蘇德霍夫鑒定出參與突觸融合的細(xì)胞質(zhì)蛋白complexin（又名synaphin），該蛋白與SNARE復(fù)合物的形成相關(guān)，進(jìn)一步研究顯示其在鈣離子介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其機(jī)制在于complexin可激活前SNARE復(fù)合物形成，而鈣離子與突觸結(jié)合蛋白結(jié)合后可代替complexin從而啟動膜融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。7、研究意義囊泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等多種“貨物”最為重要的運(yùn)輸體系，可有效保證特定分子及時、精確地在細(xì)胞內(nèi)、外發(fā)揮生物學(xué)作用，是多種生理過程正常工作的基礎(chǔ)，如神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子分泌和內(nèi)分泌系統(tǒng)激素生成和作用發(fā)揮等。囊泡運(yùn)輸精細(xì)調(diào)控也保證了生命體內(nèi)各生理過程的有序進(jìn)行，若該過程異常將導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。糖尿病是由于胰島細(xì)胞中胰島素分泌異?；蛞葝u素作用于骨骼肌或脂肪細(xì)胞時糖移位缺陷引起。參與突觸復(fù)合物組裝的α-突觸核蛋白（α-synuclein）可有效預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞衰老，它的功能缺陷可造成帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病。部分囊泡運(yùn)輸分子的基因突變還可引起遺傳學(xué)疾病的發(fā)生。3位科學(xué)家工作的重要性獲得了科學(xué)界的普遍認(rèn)可，并獲得了大量科學(xué)獎勵，羅斯曼和謝克曼因此成為2002年拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎（AlbertLaskerAwardforBasicMedicalRe