植物的細胞培養(yǎng)

植物的細胞培養(yǎng)第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)、單細胞的分離與培養(yǎng)一、分離單細胞的方法

1、物理方法

2、化學方法

3、酶法第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、物理方法將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經搖床不斷振動，使細胞分散。若向細胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細胞分散的更好。2、化學方法是在細胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽（能結合細胞間質中果膠鈣的鈣離子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（對細胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果膠酶和纖維素酶使細胞分離。第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五二、單細胞的培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、平板培養(yǎng)定義：將一定量細胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內進行培養(yǎng)的方法。第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五技術要點：單細胞懸浮液的制備：先過濾細胞懸浮液，去掉全部組織塊和大的細胞團，獲得含單細胞或4-6個的細胞團的懸浮液調節(jié)細胞密度；固體培養(yǎng)基的制備；接種細胞：把單細胞懸浮液轉移到瓊脂平板上，鋪成大約1mm的薄層，然后觀察細胞植板率。第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五植板率：它以能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比例來表示。優(yōu)點：便于定點觀察；缺點：通氣性較差。植板率(％)＝形成的細胞團數接種的細胞數×100％第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、看護培養(yǎng)1953年Muir創(chuàng)立；定義：是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)分裂和增殖的一種培養(yǎng)方法；具體方法：將單個細胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織上培養(yǎng)。第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五此法適用于難于培養(yǎng)的植物種類

優(yōu)點：簡便、成功率高缺點：不能在顯微鏡下直接觀察第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五3、液體淺層培養(yǎng)

技術：先將細胞制成一定密度的細胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟膜封口，靜置培養(yǎng)。優(yōu)點：、培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；

、細胞代謝產物容易擴散，不會造成有害物質的危害；、繼代培養(yǎng)方便、便于觀察。缺點：由于細胞可以游動，不能進行定點觀察第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五4、優(yōu)點：可以連續(xù)觀察細胞的分化和發(fā)育；缺點：通氣性差，水分難保持，pH易變動。

第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五5、懸浮細胞培養(yǎng)：將細胞接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（單獨講解）第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)、懸浮細胞培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)(suspensionculture):

是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五一、懸浮培養(yǎng)的過程：第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五二、懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產生的有害物質在局部積累而對細胞自身產生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體的交換；第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五三、懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長情況分析測定方法：1、細胞計數：單位體積細胞濃度；2、細胞體積：培養(yǎng)物離心后測定細胞層所占的體積；3、細胞鮮重或干重：過濾或干燥后稱重第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五四、懸浮細胞培養(yǎng)的同步化方法（一）物理方法（二）化學方法第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、體積選擇法：將培養(yǎng)細胞經過一定大小的篩網過濾，對細胞按大小分別進行收集。2、冷處理法：先收集細胞，后在低溫（一般為4度）下處理一定時間后加培養(yǎng)液培養(yǎng)。（一）物理方法第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、饑餓法：控制營養(yǎng)使細胞處于饑餓狀態(tài)，后加營養(yǎng)培養(yǎng)；2、有絲分裂抑制法：向培養(yǎng)液中加入化學抑制劑抑制細胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化學方法第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五五、一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較??；均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同；細胞生長迅速（2～3天加倍）。第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五六、懸浮細胞培養(yǎng)方法

分批培養(yǎng)法

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

分批培養(yǎng)法：

●是一種封閉的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)過程中不放出培養(yǎng)液，也不補加培養(yǎng)液；

●培養(yǎng)方法：旋轉培養(yǎng)；往返培養(yǎng)；旋轉振動；攪動培養(yǎng)；第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

在培養(yǎng)過程中，每隔一定時間更換一部分培養(yǎng)液或添加某種營養(yǎng)成分。

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法

通過控制連續(xù)添加和排出的新老營養(yǎng)液的量，維持培養(yǎng)液體積恒定，據操作的不同又可分為封閉式和開放式兩種。●封閉式：回收流出的細胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞數目增加●開放式：流出的細胞不回收于培養(yǎng)系統(tǒng)中，但進行細胞收獲第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五七、影響懸浮細胞生長的因素：起始愈傷組織的質量；接種細胞密度；培養(yǎng)條件：方式、溫度；繼代周期。第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五八、細胞的保存繼代培養(yǎng)保存法：細胞定期繼代培養(yǎng)，常用；低溫保存法：5－10度溫度下培養(yǎng)并定期更換培養(yǎng)液；冰凍保存法：分為低溫保存（－20度）和超低溫保存（液氮保存）第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)、植物細胞培養(yǎng)的應用

植物細胞含有人類所需的成分，包括初生代謝物（蛋白質、碳水化合物、脂肪等）和次生代謝物（多酚類、香精油、生物堿、樹脂等），傳統(tǒng)提取分離這些物質由于資源短缺和需求量的加大，難以滿足需求，通過細胞培養(yǎng)生產植物產品成為解決的有效途徑。

第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（一）、細胞培養(yǎng)的主產品1、藥用代謝產物

生物堿（吡啶、喹啉）、蛋白質類（氨基酸、植物抗生素、）、酚類化合物（黃酮類、單酚類、醌類）、萜類化合物（三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜）等。豆杉細胞紫杉醇（抗癌藥物）紫草細胞紫草寧（燒傷、痔瘡）例子：第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、天然食品、食品添加劑色素（胡蘿卜素、葉黃素、單寧）、甜味劑（甜菊苷）、香料物質、飲料（可可堿、咖啡堿）等；3、殺蟲劑、殺菌劑萬壽菊細胞中獲得農藥噻吩烷；鷹嘴豆細胞中得到除蟲菊脂；香草細胞中分離到魚藤酮殺蟲劑等；4、飼料、精細化工產品桑細胞培養(yǎng)養(yǎng)蠶飼料銀膠菌細胞培養(yǎng)橡膠第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（二）、細胞培養(yǎng)技術的優(yōu)點1、培養(yǎng)細胞是在無菌條件下生長的,不受地區(qū)、季節(jié)和氣候限制；2、占地面積少；3、天然產物的生產在控制的條件下進行,可以得到超越整體植物產量的代謝產物；4、能夠產生原植物所沒有的，甚至是至今在自然界還沒有的化合物。第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（三）、植物細胞生物反應器

生物反應器的特點：

在可控制條件下（物理和化學），細胞得到大規(guī)模培養(yǎng)（工作體積大），而且單位體積生產能力高。第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、植物細胞培養(yǎng)特性細胞本身的特性細胞培養(yǎng)液的流變特性培養(yǎng)過程的氣體傳遞與影響泡沫與器壁表面黏附性細胞分裂與愈傷組織的形成懸浮細胞分批培養(yǎng)生長特點第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（1）、細胞本身的特性細胞體積比微生物細胞大（10－200μm）,是微生物細胞的30－100倍；植物細胞生長速度慢；植物細胞壁易受機械剪切力的影響；細胞常以非均相集合細胞團的方式生長第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（2）、細胞培養(yǎng)液的流變特性體現在兩方面：首先，細胞培養(yǎng)中易結團其次，細胞培養(yǎng)過程中易產生黏多糖等物質，降低傳氧速度，影響細胞生長。（3）、培養(yǎng)過程的氣體傳遞與影響植物細胞培養(yǎng)需通過光合作用，植物細胞都好氧，因此培養(yǎng)過程需注意o2和co2的供應及比例關系。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（4）、泡沫與器壁表面黏附性：植物細胞在培養(yǎng)過程中易分泌黏多糖、蛋白質等物質導致黏度增大；植物培養(yǎng)過程中易產生大量氣泡。對策：

利用消泡劑和在器皿表面涂抹硅油第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（5）、細胞分裂與愈傷組織的形成單個細胞3－5天內可觀察到細胞分裂，根據培養(yǎng)的目的不同選取策略：

快繁種苗：細胞分裂長成小細胞團后形成小愈傷組織塊，然后轉到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

生產細胞代謝產物：分散細胞團，保持細胞分裂第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（6）、懸浮細胞分批培養(yǎng)生長特點延遲期：也叫適應期，細胞很少分裂對數生長期：細胞開始分裂，并以幾何級數增加減緩期：細胞分裂減速靜止期（穩(wěn)定期）：生成的和死亡的細胞數目達到平衡，總數不變衰亡期：細胞加快死亡第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、生物反應器培養(yǎng)過程：1）、細胞的馴化、篩選與細胞株的建立

愈傷組織的誘導與培養(yǎng)單細胞的分離（機械或酶解法）細胞無性系的分離（過濾涂板培養(yǎng)）細胞株的篩選（選疏松長勢好的細胞

株，并測定細胞代謝物含量）第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五生長速度快；目的代謝產物含量高；適合懸浮細胞培養(yǎng)。適合大規(guī)模培養(yǎng)的細胞株應具備何條件？第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2）、擴大培養(yǎng)逐級放大，用作培養(yǎng)的種子；細胞株鑒定：經常鑒定，防止細胞株退化和變異。3）、生物反應器培養(yǎng)

培養(yǎng)方式同微生物，可以是分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)。第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、影響生物反應器細胞培養(yǎng)的主要因素1）、細胞遺傳特性

取材部位、細胞株的選擇2）、培養(yǎng)的環(huán)境條件

主要因素包括光照、溫度、攪拌與混合、通氣、營養(yǎng)鹽、pH、調節(jié)因子第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五3、生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)固定化培養(yǎng)系統(tǒng)第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1）、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

類型溶氧破壞性混合度限制因素氣升攪拌式高低均勻細胞濃度高時有死角機械攪拌式中強較均勻細胞濃度高時混合不勻鼓泡式中低不均勻有死角，發(fā)生細胞沉降第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)機械攪拌式氣升攪拌式第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2）、固定化培養(yǎng)系統(tǒng)

特點：細胞固定而培養(yǎng)液循環(huán)流動

按照其支持物不同可以分為兩大類：

A、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺；B、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：尼龍網、聚氨酯泡沫、中空纖維。第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五常見的幾種固定化培養(yǎng)系統(tǒng)流化床生物反應器：細胞包裹在膠粒、泡沫顆粒中，通入空氣使固定化細胞懸浮于反應器中；填充床生物反應器：細胞固定在膠粒、泡沫顆?；蜻B續(xù)的多個網中，細胞固定不動通過流動的培養(yǎng)液傳質；膜生物反應器：常見的是中空纖維和螺線式卷繞反應器，傳質效率低，易阻塞，產物收獲較困難，投資大。第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五流化床生物反應器填充床生物反應器膜生物反應器－－－中空纖維思考：固定化有何優(yōu)勢？第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五(1)固相細胞接觸緊密,生長緩慢,細胞擬組織化,有利于次生產物的積累；(2)細胞包埋在聚合物中得到保護，可以減少剪切力的損傷作用；(3)易于把細胞與培養(yǎng)液分開，更有利連續(xù)培養(yǎng)及生物轉化過程的實現；固定化細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五(4)高密度的細胞群體，可建立細胞間的物理、化學聯系，細胞位置的相對固定，有利于物化梯度的建立，更有利于產物的合成;(5)環(huán)境條件易于控制，次生代謝物易于釋放。存在的問題：a產物釋放

b氧、養(yǎng)分傳遞第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五染色法：如用二乙酸熒光素（FDA）：活細胞能吸收并降解產生熒光，死亡細胞則無此現象。呼吸強度測定法：采用氧電極法測定；細胞生長速率的測定：對細胞數量或重量進行測定。固定化細胞活力的測定：第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、兩步培養(yǎng)技術二、提高天然產物代謝新技術1977年Zenk提出：(1)維持培養(yǎng)基(maintenancemedia)

——盡可能快的使細胞量增長(