核酸核酸的理化性質(zhì)

核酸核酸的理化性質(zhì)第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五核酸的性質(zhì)及序列測定第四節(jié)第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五一、核酸的一般理化性質(zhì)1、狀態(tài)：DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有機溶劑（乙醇沉淀核酸），其鈉鹽易溶于水；3、粘度：DNA的粘度極高，而RNA粘度要小得多；（一）物理性質(zhì)第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。3',5'-磷酸二酯鍵斷裂切割點不同，產(chǎn)物不同，如3‘-單核苷酸，5’-單核苷酸水解磷酸二酯鍵的酶：核酸酶（二）穩(wěn)定性核酸可被酸、堿或酶水解成各種組分，即核酸的降解第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五（1）堿水解：RNA可在室溫下被稀堿水解成核苷酸，而DNA對堿穩(wěn)定。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎完全水解，隨著磷酸二酯鍵的斷裂，先生成2′,3′-環(huán)核苷酸中間物，最后生成2′-或3′-磷酸核苷的混合物；DNA由于不存在2′-OH，不能被堿水解。

利用上述性質(zhì)可測定RNA的堿基組成或除去溶液中的RNA。1、酸或堿水解

DNA和RNA對酸或堿的耐受程度不同。第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五（2）酸水解

酸性條件下，磷酸二酯鍵比糖苷鍵穩(wěn)定，嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵穩(wěn)定性最差。若對核酸進行酸水解，首先生成的是無嘌呤酸。因此對核酸進行部分水解時，很少采用酸水解。1、酸或堿水解

第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五根據(jù)底物不同：DNA水解酶（DNase）

RNA水解酶（RNase）根據(jù)作用方式：核酸外切酶(限制性和非限制性)

核酸內(nèi)切酶(5′→3′或3′→5′)核酸內(nèi)切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開始，逐個水解切除核苷酸3、酶水解核酸酶分類第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五5’5’3’3’外切位點外切位點內(nèi)切位點內(nèi)切位點第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五實驗室常用的RNase有3種：

牛胰核糖核酸酶（RNaseI）：專一性內(nèi)切酶，產(chǎn)物為3′-嘧啶核苷酸及以3′-嘧啶核苷酸為結尾的寡核苷酸。核糖核酸酶T1：產(chǎn)物為3′-嘌呤核苷酸及以3′-嘌呤核苷酸為結尾的寡核苷酸。核糖核酸酶T2：主要作用于Ap殘基，將tRNA降解為3′-腺苷酸為末端的寡核苷酸。3、酶水解第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五實驗室常用的DNase有2種：

牛胰脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）：水解產(chǎn)物為平均長度為4個核苷酸，以5′-P為末端的寡聚核苷酸。牛胰脫氧核糖核酸酶II（DNaseII）：水解產(chǎn)物為平均長度為6個核苷酸，以3′-P為末端的寡聚核苷酸。3、酶水解第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五

非特異性核酸酶：即水解DNA又水解RNA的酶。有些非特異性核酸酶也作為工具酶應用到科學研究中。如：蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶均是水解DNA和RNA的外切核酸酶。前者從3′端開始，生成5′單核苷酸，后者從

5′末端開始，生成3′單核苷酸。

D-核糖與濃鹽酸和苔黑酚（甲基間苯二酚）共熱產(chǎn)生綠色；

D-2-脫氧核糖與酸和二苯胺一同加熱產(chǎn)生藍紫色。以此區(qū)別DNA和RNA，或作為定量測定基礎。

第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五二、核酸的紫外吸收第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五DNA或RNA的定量A260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg/ml單鏈DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸確定樣品中核酸的純度

純DNA:A260/A280=1.8

純RNA:A260/A280=2.0紫外吸收的應用第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有堿性基團（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿性（氨基）是一個弱堿，所以核酸的等電點比較低。如DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5。三、核酸的酸堿性質(zhì)及等電點第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五1、概念：指核酸的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，空間結構破壞，形成單鏈無規(guī)則線團狀態(tài)的過程2、變性因素：加熱、酸堿度改變、有機溶劑、酰胺、尿素等。3、DNA變性的實質(zhì)：DNA雙鏈間氫鍵的斷裂，生物活性喪失。四、核酸的變性、復性與雜交

（一）核酸的變性第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五4、特點：并不涉及共價鍵的斷裂，即磷酸二酯鍵不發(fā)生斷裂，因此一級結構不發(fā)生變化。5、變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變。

（一）核酸的變性第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五增色效應(hyperchromiceffect)：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。6、DNA的熱變性和熔解溫度（Tm）第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五DNA的解鏈曲線連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度相對于A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。解鏈過程中，紫外吸光度的變化達到最大變化值的一半時所對應的溫度，稱為熔解溫度，用Tm表示，也稱解鏈溫度。熔解溫度(meltingtemperature,Tm)第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五（1）G-C對含量：G-C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)×2.44（2）溶液的離子強度：離子強度較低的介質(zhì)中DNA的Tm較低。在純水中，DNA在室溫下變性。（3）溶液的pH值和變性劑影響Tm的因素第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五1、復性：變性DNA在適當條件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成為雙螺旋結構的過程退火：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性，又稱“退火”。

（二）核酸的復性第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五2、復性表現(xiàn)：許多理化性質(zhì)可恢復，生物活性得以部分恢復。

3、影響復性的因素：分子量越大復性越難；濃度越大，復性越容易；DNA的復性也與它本身的組成和結構有關。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關。

（二）核酸的復性第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五DNA復性第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五

核酸雜交：核酸變性后進行復性的過程中，來源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子的過程。 雜交雙鏈可在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復性。 核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。

（三）核酸的雜交第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期五核酸