實驗三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

一、目的

掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作。了解電泳技術的一般原理。第一頁，共13頁。二、原理

帶電質點向著與它所帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。帶電質點之所以能在電場中向一定的方向移動，并具有一定的移動速度，是取決于帶電質點本身所帶的電荷、電場強度、溶液的pH等因素。蛋白質分子在溶液中的電泳是由于蛋白質的分子具有一些自由的可解離的基團如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某種pH值溶液中蛋白質分子就帶有一定的電荷。一個混合的蛋白質樣品由于各蛋白質的等電點不同，在相同的pH溶液中所帶的電荷性質不同，電荷的數(shù)目不同，在電場中各種蛋白質泳動的方向和速度也不同，從而使蛋白質混合樣品得到分離。第二頁，共13頁。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各種蛋白質由于氨基酸組分、立體構象、相對分子質量、等電點及形狀不同（見下表），在電場中移動速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質的等電點大部分低于pH7.0所以在緩沖液（pH值8.6）中，它們都電離成負離子，在電場中向陽極移動。蛋白質名稱白蛋白α1–球蛋白α2–球蛋白β–球蛋白γ–球蛋白等電點（pI）4.885.065.065.126.85～7.50相對分子量/Mr6900020000030000090000～150000156000～300000第三頁，共13頁。在一定范圍內(nèi)，蛋白質的含量與結合的染料量成正比，故可將各蛋白質區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下來，進行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計掃描，測定其相對含量。本實驗采用的醋酸纖維薄膜電泳，是以醋酸纖維薄膜為支持物的電泳方法。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維醋酸酯。將它溶于有機溶劑(如：丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后，涂成均勻的薄膜，待溶劑蒸發(fā)后則成為醋酸纖維薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結構，有強滲透性、其厚度約為120μm。第四頁，共13頁。醋酸纖維薄膜電泳是近幾年來推廣的一種新技術。它具有微量、快速、簡便、分辨力高、對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點。目前已廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結合球蛋白、同工酶的分離及測定方面。三、器材1、醋酸纖維薄膜(2×8cm)2、常壓電泳儀3、點樣器(市售或自制)4、培養(yǎng)皿(染色及漂洗用)5、粗濾紙6、玻璃板7、竹鑷第五頁，共13頁。四、試劑1．硼酸緩沖液（PH8.6,離子強度0.075mol/L）硼酸5.6025g，四硼酸納5.6099g，氯化鈉1.3163g，加蒸餾水至1000mL2．染色液300mL含氨基黑10B0．25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL,水40mL(可重復使用)。3．漂洗液2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。4.透明液(現(xiàn)用現(xiàn)配）無水乙醇:冰醋酸＝7:3第六頁，共13頁。五、操作1．浸泡用鑷子取醋酸纖維薄膜1張（8*2cm），識別出光澤面與無光澤面，并在角上用筆做上點樣線（膜條一端1.5cm處，用鉛筆橫畫一條線）放在巴比妥緩沖液中浸泡20分鐘。整條薄膜一致而無白點，則表明薄膜質地均勻(實驗中應選擇質地均勻的膜)第七頁，共13頁。2．點樣把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上(無光澤面朝上)。取一滴樣品（血清）放置在載玻片上，用蓋玻片的一端截面（玻璃寬度應小于薄膜的寬度），沾適量的樣品（樣品吸附高度約1-2mm，高度均一。），然后將其截面與薄膜上點樣線處輕輕水平地落下并隨即提起，樣品呈一條線“印”在薄膜上，使樣品盡量點得細窄而均勻，這樣即在膜條上點上了細條狀的血清樣品。第八頁，共13頁。3．電泳在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個電極槽內(nèi)的液面等高，將將點好樣的薄膜(無光澤面朝下)兩端平懸于電泳槽支架的濾紙橋(先剪裁尺寸合適的濾紙條，取雙層濾紙條附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對齊，而另一端浸入電極槽的緩沖液內(nèi)。用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為濾紙橋，它是聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的“橋梁”。)上。膜條上點樣的一端靠近負極。蓋嚴電泳室。平衡10min后，通電。調(diào)節(jié)電壓至160V，電流強度0．4～0．7mA／cm(毫安／厘米)膜寬，電泳時間約為60分鐘。第九頁，共13頁。4．染色電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡10分鐘。5．漂洗將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗數(shù)次（3-4次，每次5min）至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，用濾紙吸取多余液體，可得色帶清晰的電泳圖譜。6.透明將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡2~3min后取出貼于潔凈玻璃板上，干后即為透明的薄膜圖譜，可用光密度計直接測定。第十頁，共13頁。六、注意事項1、保持醋酸纖維素薄膜的清潔，避免用手直接接觸薄膜。2、點樣量要適宜，2次左右即可，蓋玻片的邊緣應避免出現(xiàn)明顯液滴。點樣要盡量點在一條直線上。（此步是實驗的關鍵,點樣前應在濾紙上反復練習,掌握點樣技術后再正式點樣。）3、電泳時間不低于1小時。4、點樣處不要搭在濾紙上，以免血清滲入濾紙。5、醋酸纖維素薄膜應繃直，避免電泳槽隔離板的干擾。6、不可同時接觸正負極，防止觸電。第十一頁，共13頁。結果分析：1、區(qū)帶不分離，沒有出現(xiàn)理論上的5條帶。原因：電泳時間不夠，電壓偏低，點樣量過多。2、區(qū)帶不清晰，顏色很淺。原因：點樣量不夠。3