蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)存在于所有生物細胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎，參與了幾乎所有的生命活動過程?，F(xiàn)在是1頁\一共有106頁\編輯于星期五一、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學組成和分類１、元素組成蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物

現(xiàn)在是2頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是3頁\一共有106頁\編輯于星期五２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)6.25凱氏定氮法現(xiàn)在是4頁\一共有106頁\編輯于星期五三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白質(zhì)的4.16倍?，F(xiàn)在是5頁\一共有106頁\編輯于星期五３、蛋白質(zhì)的分類（1）、依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

外形接近球形或橢圓形，溶解性較好纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein形似纖維或細棒，分可溶性/不溶性兩種膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

親水性殘基少于胞質(zhì)蛋白現(xiàn)在是6頁\一共有106頁\編輯于星期五（2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類單純蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成綴合蛋白

conjugatedprotein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成現(xiàn)在是7頁\一共有106頁\編輯于星期五單

純

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin廣泛存在于動物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿魚精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細胞核硬蛋白存在于軟骨、腱、毛發(fā)、絲等組織中，分為角/膠原/彈性/和絲蛋白等現(xiàn)在是8頁\一共有106頁\編輯于星期五綴

合

蛋

白糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡單蛋白+核酸磷蛋白：含與Ser,Thr和Tyr殘基的羥基酯化的磷酸基。金屬蛋白：含有金屬離子的蛋白質(zhì)血紅素蛋白：金屬蛋白的一個亞類；輔基為血紅素，是卟啉化合物。黃素蛋白：含黃素，輔基為FMN和FAD?，F(xiàn)在是9頁\一共有106頁\編輯于星期五（3）蛋白質(zhì)按生物學功能分類酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等調(diào)節(jié)因子：如胰島素、促生長素、促甲狀腺素等轉(zhuǎn)運蛋白：如血紅蛋白、血清清蛋白、和葡糖轉(zhuǎn)運蛋白貯存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和鐵蛋白收縮和游動蛋白：肌動蛋白、肌球蛋白、動力蛋白結(jié)構(gòu)蛋白：角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、絲蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：如胰島素受體底物-1、A激酶錨定蛋白和信號傳遞轉(zhuǎn)錄激活劑保護和開發(fā)蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纖蛋白原、抗凍蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等異常蛋白：如應樂果甜蛋白、節(jié)肢彈性蛋白和膠質(zhì)蛋白現(xiàn)在是10頁\一共有106頁\編輯于星期五（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子對任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在是11頁\一共有106頁\編輯于星期五人為規(guī)定Pr分子量上下限下限一般認為從胰島素開始，其相對分子量為5700（51個氨基酸殘基）某些Pr由兩至多個亞基經(jīng)非共價結(jié)合而成（寡聚蛋白）分子量高達數(shù)百/千萬。如谷酰胺合成酶（12個亞基組成），如煙草花葉病毒（2130個亞基和一條RNA鏈構(gòu)成。現(xiàn)在是12頁\一共有106頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)與多肽無嚴格的界線——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500對于不含輔基的單純蛋白質(zhì)，相對分子量/110≈aa殘基數(shù)20種aa的平均分子量約為138，較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均分子質(zhì)量為128。形成一個肽鍵失去一分子水（分子量18），aa殘基的平均分子量為110。100個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約為多少？現(xiàn)在是13頁\一共有106頁\編輯于星期五（三）、蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象現(xiàn)在是14頁\一共有106頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)的基本概念一級（1o）結(jié)構(gòu)：肽鏈中的氨基酸排列順序。二級（2o）結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的a螺旋和b折疊股片段。三級（3o）結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價鍵（非共價力）彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。四級（4o）結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關系和結(jié)合方式。一個蛋白質(zhì)分子為獲得復雜結(jié)構(gòu)所需的全部信息都含于1o結(jié)構(gòu)即多肽鏈的氨基酸序列中現(xiàn)在是15頁\一共有106頁\編輯于星期五示例現(xiàn)在是16頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是17頁\一共有106頁\編輯于星期五肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)和丙酮磷酸異構(gòu)酶的三級結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是18頁\一共有106頁\編輯于星期五血紅蛋白四級結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是19頁\一共有106頁\編輯于星期五（四）、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運功能-膜轉(zhuǎn)運蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能現(xiàn)在是20頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是21頁\一共有106頁\編輯于星期五生老病死，萬物輪回(蛋白質(zhì)層次)生（誕生、生長）：在酶催化下老細胞計劃性凋亡和新細胞的再生（新陳代謝）、活細胞的代謝老？蛋白質(zhì)功能普遍衰退(?)病—個別蛋白質(zhì)的功能障礙死？蛋白質(zhì)功能的全部停止/分解

蛋白質(zhì)——生物功能分子現(xiàn)在是22頁\一共有106頁\編輯于星期五單細胞生物胞外酶鞭毛-蛋白質(zhì)（運動器官）細胞壁-糖、脂、肽細胞膜-載運蛋白、膜蛋白細胞質(zhì)-酶蛋白（催化物質(zhì)代謝）細胞核-酶蛋白（遺傳）現(xiàn)在是23頁\一共有106頁\編輯于星期五多細胞動物個體層次毛發(fā)、皮膚-角蛋白骨骼、牙齒-鈣+膠原蛋白肌肉-肌球蛋白/肌絲蛋白現(xiàn)在是24頁\一共有106頁\編輯于星期五二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。現(xiàn)在是25頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是26頁\一共有106頁\編輯于星期五由兩個AA組成的肽稱為二肽。含幾個至十幾個AA的肽鏈稱為寡肽由20個AA以上組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基?，F(xiàn)在是27頁\一共有106頁\編輯于星期五多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln反過來寫的是一個不同的肽現(xiàn)在是28頁\一共有106頁\編輯于星期五肽鍵是aa間的基本連接方式。證據(jù)：１、Pr中游離α－氨基和α－羧基很少。２、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。３、Pr能發(fā)生雙縮脲反應（紫紅色或藍紫色）４、人工合成的多聚aa的Ｘ－射線衍射圖案和紅外吸收光譜與天然的纖維狀蛋白質(zhì)十分相似。５、我國首次人工合成－結(jié)晶牛胰島素?，F(xiàn)在是29頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵的特點是：——N上孤對電子與羰基有明顯的共軛作用。現(xiàn)在是30頁\一共有106頁\編輯于星期五①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式結(jié)構(gòu)存在現(xiàn)在是31頁\一共有106頁\編輯于星期五共價主鏈

現(xiàn)在是32頁\一共有106頁\編輯于星期五（二）、肽的物理化學性質(zhì)離子晶格，在水溶液中以偶極離子存在。肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。酸堿性質(zhì)取決于：—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團的解離等電點，靜電荷為零時溶液的pH值。肽的化學反應也和AA一樣，游離的α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團可以發(fā)生類似AA的反應，如茚三酮反應。具有雙縮脲反應—肽特有的反應。（紫紅色或藍紫色）現(xiàn)在是33頁\一共有106頁\編輯于星期五（三）、天然存在的活性肽生物體中多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位；有許多分子量比較小的寡（多）肽以游離狀態(tài)存在，這類肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽、激素類多肽、抗生素類多肽、谷胱甘肽、蛇毒多肽等現(xiàn)在是34頁\一共有106頁\編輯于星期五

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽Leu-腦啡肽現(xiàn)在是35頁\一共有106頁\編輯于星期五

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短桿菌肽S(環(huán)十肽)

由細菌分泌，含有D-AA和一些不常見AA，如鳥氨酸（Ornithine,Orn）。

現(xiàn)在是36頁\一共有106頁\編輯于星期五鵝膏覃堿是一種環(huán)狀八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制劑（能與RNA聚合酶緊緊結(jié)合）現(xiàn)在是37頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是38頁\一共有106頁\編輯于星期五三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)AA順序測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)現(xiàn)已有成千上萬種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。

什么是Pr的一級結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。現(xiàn)在是39頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是40頁\一共有106頁\編輯于星期五1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質(zhì)的分子量3.知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成4.測定蛋白質(zhì)的AA組成并根據(jù)分子量計算每種AA的個數(shù)5.測定水解液中的氨量計算酰胺的含量蛋白質(zhì)測序前提現(xiàn)在是41頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略(1)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定現(xiàn)在是42頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定現(xiàn)在是43頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定現(xiàn)在是44頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定現(xiàn)在是45頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁\一共有106頁\編輯于星期五巰基（-SH）的保護現(xiàn)在是47頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(4)測定每條多肽鏈的AA組成，并計算出AA成分的分子比部分樣品進行完全水解，測定氨基酸組成現(xiàn)在是48頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是49頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定現(xiàn)在是50頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）、蛋白質(zhì)測序策略(7)測定每個肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序?，F(xiàn)在是51頁\一共有106頁\編輯于星期五(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。（一）、蛋白質(zhì)測序策略蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定胃蛋白酶水解現(xiàn)在是52頁\一共有106頁\編輯于星期五兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：N-端氨基酸C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測定現(xiàn)在是53頁\一共有106頁\編輯于星期五Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色現(xiàn)在是54頁\一共有106頁\編輯于星期五二甲氨基萘磺酰-AA有強熒光，檢測靈敏度高丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N堿性條件(DNS-aa)現(xiàn)在是55頁\一共有106頁\編輯于星期五苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N現(xiàn)在是56頁\一共有106頁\編輯于星期五—N=C=S+N—CH—CO—NH—C·······HHR1PITC—N—C—N—CH—CO—NH—C·······HHRSPTC-多肽—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITCR2多肽+N—CH—CO—NH—C·······HHR2R3少一個氨基酸的多肽現(xiàn)在是57頁\一共有106頁\編輯于星期五肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個向里水解根據(jù)不同反應時間測出釋放的AA種類和數(shù)量，按反應時間和AA殘基釋放量作動力學曲線蛋白質(zhì)N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N現(xiàn)在是58頁\一共有106頁\編輯于星期五氨基酸酰肼可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)。上清中的氨基酸可通過其他方法鑒定①肼解法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C1～n-1現(xiàn)在是59頁\一共有106頁\編輯于星期五（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C

C末端AAα氨基醇水解肽鏈，鑒定α氨基醇②還原法硼氫化鋰現(xiàn)在是60頁\一共有106頁\編輯于星期五肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個水解根據(jù)不同反應時間釋放出的AA種類和數(shù)量蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵∽Y：可作用于任何一個C-末端殘基的肽鍵③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C現(xiàn)在是61頁\一共有106頁\編輯于星期五（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價力。應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。現(xiàn)在是62頁\一共有106頁\編輯于星期五1、酸水解常用6M鹽酸或4M硫酸優(yōu)點：水解產(chǎn)物不消旋缺點：Trp被沸酸完全破壞含羥基Ser、Thr、Tyr部分分解Asn、Gln酰胺基被水解（四）、氨基酸組成的分析現(xiàn)在是63頁\一共有106頁\編輯于星期五2、堿水解一般用5M氫氧化鈉缺點：許多AA受到不同程度的破壞部分水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化優(yōu)點：Trp不受破壞（四）、氨基酸組成的分析現(xiàn)在是64頁\一共有106頁\編輯于星期五1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化目前序列分析方法最長只能幾十個殘基，因此需要裂解多肽，然后分離純化。現(xiàn)在是65頁\一共有106頁\編輯于星期五R1=Lys（K）或Arg（R）專一性較強，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點胰蛋白酶trypsin減少斷裂點：保護Lys側(cè)鏈ε-NH2或修飾Arg胍基增加斷裂點：將Cys變?yōu)轭愃芁ys的結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是66頁\一共有106頁\編輯于星期五R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關:酸性：-/堿性：+現(xiàn)在是67頁\一共有106頁\編輯于星期五R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的AA水解速度較快肽鏈水解位點R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)現(xiàn)在是68頁\一共有106頁\編輯于星期五R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點胃蛋白酶Pepsin現(xiàn)在是69頁\一共有106頁\編輯于星期五肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶現(xiàn)在是70頁\一共有106頁\編輯于星期五2、化學裂解法①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解現(xiàn)在是71頁\一共有106頁\編輯于星期五

②NH2OH斷裂：較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分斷裂

現(xiàn)在是72頁\一共有106頁\編輯于星期五3、肽段的分離純化：

凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法現(xiàn)在是73頁\一共有106頁\編輯于星期五N-端分析法

特點：能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出?，F(xiàn)在是74頁\一共有106頁\編輯于星期五無水氨基非質(zhì)子化PITCPTC-肽現(xiàn)在是75頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是76頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是77頁\一共有106頁\編輯于星期五2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質(zhì)譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測定速度快現(xiàn)在是78頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是79頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是80頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是81頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是82頁\一共有106頁\編輯于星期五核糖體蛋白質(zhì)鏈4.根據(jù)核苷酸序列的推定法現(xiàn)在是83頁\一共有106頁\編輯于星期五根據(jù)核苷酸序列的推定法：（1）用待測的蛋白質(zhì)作抗原免疫動物抗體（2）分離多核糖體（3）抗體沉淀此種蛋白質(zhì)多核糖體（4）分離該蛋白質(zhì)的模板mRNA，（5）反轉(zhuǎn)錄成cDNA（6）根據(jù)測定cDNA序列推測蛋白質(zhì)的AA序列。注意：必須知道蛋白質(zhì)N-末端和C-末端氨基酸殘基現(xiàn)在是84頁\一共有106頁\編輯于星期五（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（overlapingpeptide）現(xiàn)在是85頁\一共有106頁\編輯于星期五胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈經(jīng)電泳分離各肽段用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向90℃二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置（八）、二硫鍵位置的確定現(xiàn)在是86頁\一共有106頁\編輯于星期五胃蛋白酶最適pH約2，此時二硫鍵不斷開專一性低、肽段短現(xiàn)在是87頁\一共有106頁\編輯于星期五（九）、蛋白質(zhì)測序舉例現(xiàn)在是88頁\一共有106頁\編輯于星期五（十）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫

www.ncbi.nlm.現(xiàn)在是89頁\一共有106頁\編輯于星期五

同源蛋白質(zhì)：來自不同生物體、

執(zhí)行同一/相似功能的蛋白質(zhì)

同種蛋白質(zhì)：來自相同生物體、

執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)

同源蛋白質(zhì)的AA序列具有明顯的相似性

——序列同源性（sequencehomology）

不變殘基/可變殘基1、同源蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的AA序列與生物功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化現(xiàn)在是90頁\一共有106頁\編輯于星期五

一百多個AA殘基

MW約12.5×103

28個不變殘基

序列間AA差異數(shù)與物種間系統(tǒng)發(fā)生差異成比例；

進化位置上相差愈遠，AA序列之間的差別愈大。

細胞色素C的AA序列差異可用于核對各物種間的分類學關系以及繪制系統(tǒng)樹/進化樹。

2、細胞色素C與系統(tǒng)樹現(xiàn)在是91頁\一共有106頁\編輯于星期五invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences現(xiàn)在是92頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是93頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是94頁\一共有106頁\編輯于星期五序列同源關系表明隨機突變導致一級結(jié)構(gòu)方面AA取代/趨異事件的進化順序。

1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源現(xiàn)在是95頁\一共有106頁\編輯于星期五該酶類活性中心的Ser殘基起關鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶和纖溶酶有序列同源性對底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類現(xiàn)在是96頁\一共有106頁\編輯于星期五卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三級結(jié)構(gòu)很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差異很大的蛋白質(zhì)現(xiàn)在是97頁\一共有106頁\編輯于星期五（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂

凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘难w蛋白網(wǎng)?？扇苄缘难w蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纖蛋白網(wǎng)現(xiàn)在是98頁\一共有106頁\編輯于星期五現(xiàn)在是99頁\一共有106頁\編輯于星期五（一）肽的人工合成

保護（氨基、羧基、側(cè)鏈活性基團）

活化（氨基、羧基）

縮合劑

（二）胰島素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成現(xiàn)在是100頁\一共有106頁\編輯于星期五樹脂掛接現(xiàn)在是101頁\一共有106頁\編輯于星期五1.有一多肽經(jīng)酸水解后產(chǎn)生等摩爾的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解該肽，僅發(fā)現(xiàn)有游離的Gly和一種二肽。下列多肽的一級結(jié)構(gòu)中，哪一個符合該肽的結(jié)構(gòu)?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys

2.測定小肽氨基酸順序的最好方法是A.2，4-二硝基氟苯法(FDNB法)B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法)C.氨肽酶法D.苯異硫氰酸法(PITC法)E.羧肽酶法

選擇題現(xiàn)在是102頁\一共有106頁\編輯于星期五3.用下列方法測定蛋白質(zhì)含量，哪一種方法需要完整的肽鍵?A.雙縮脲反應B.克氏定氮C.紫外吸收D.茚三酮