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文檔簡(jiǎn)介

植物總RNA的提取及RT-PCR生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

植物總RNA的提取及RT-PCR

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)從植物組織中提取總RNA的方法

2.了解RT-PCR的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.RNA提取的原理

RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。

2.RT-PCR的原理

提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因和合成cDNA探針等。

三、儀器、藥品與試劑配方

(一)儀器及器皿

1．低溫離心機(jī)；2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)；3．高壓滅菌鍋；

4.PCR儀；5．研缽；6.一次性手套等；

7.離心管；8.培養(yǎng)皿；9.燒杯及試劑瓶等。

(二)藥品

1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.異硫氰酸胍(GT)3.醋酸鈉(NaAc)

4.苯酚5.異丙醇6.氯仿

7.乙醇8.β－巰基乙醇9.瓊脂糖

10.MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒11.TaqDNA聚合酶12.引物

(三)試劑配制

1．0.1%DEPC水滅菌

2.4mol/L異硫氰酸胍

3.2mol/LNaAc（pH4.8）滅菌

4.3mol/LNaAc（pH4.8）滅菌

5.4mol/LLiCl滅菌

6.1TE緩沖液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）,滅菌。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）總RNA的提取

（1）研缽冷卻后，倒入2/3液氮，加入0.2g植物材料，充分研磨后轉(zhuǎn)入一個(gè)含有300

l的4MGT的1.5ml的聚丙烯管中，搖勻

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