57節(jié)酶組成結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制2023課件

第五節(jié)酶組成、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制一、酶在生物體內(nèi)的分布GPT與尿激酶、心肌中的細(xì)胞色素氧化酶

生物體自身需要決定了酶的生物合成，酶的生物合成機(jī)制決定了酶在生物體內(nèi)的分布和所處環(huán)境狀態(tài)；所以：它們或定位于某亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上處于“溶解”狀態(tài)；不同生物體細(xì)胞內(nèi)酶的數(shù)量和種類不同；同一生物體內(nèi)的不同部位或不同生長發(fā)育階段的細(xì)胞內(nèi)酶的數(shù)量、種類不同；

SOD

對微生物酶來說，合成后分泌有兩種情況：

1、胞外酶（分泌型酶）是指可以穿過質(zhì)膜的任何酶，大多數(shù)是水解酶，大多數(shù)工業(yè)用酶是胞外酶。

優(yōu)點(diǎn)：它比胞內(nèi)酶容易回收、純化，不必將細(xì)胞破碎，也不用去核酸，容易獲得高產(chǎn)。

基因工程中外源蛋白最終在周質(zhì)中表達(dá)的情況，常給工作帶來許多麻煩。用基因工程手段獲得的微生物高產(chǎn)外源酶常會被宿主本身的蛋白酶迅速降解。因此，盡可能的使產(chǎn)生的外源酶分泌到細(xì)胞質(zhì)膜外，是穩(wěn)定外源酶的有效措施之一。關(guān)于胞外酶分泌機(jī)制現(xiàn)在有一種信號肽假說。2、胞內(nèi)酶

是指合成后仍然在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶。

細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)的非均一性決定了酶分布和所處狀態(tài)非均一，或處于“溶解”狀態(tài)，或定位結(jié)合于某一特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中；由于細(xì)胞器的分工，某些酶對特定細(xì)胞來說是獨(dú)有或主要的；各細(xì)胞器上往往集中了具各自特征的酶系統(tǒng)（標(biāo)記酶）。

對于標(biāo)記酶,有以下幾例：質(zhì)膜：主要兩種：Na+、K+-ATP酶、腺甘酸環(huán)化酶；細(xì)胞核：主要是擔(dān)負(fù)DNA與RNA合成的酶。如：RNA甲基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶等；

線粒體：主要集中了參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、呼吸鏈、氧化磷酸化等與能量代謝有關(guān)的酶和酶系。如：NADH脫氫酶、己糖激酶等；溶酶體：各種水解酶（約60種左右）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：蛋白質(zhì)合成、脂類合成、藥物轉(zhuǎn)化的酶。如：細(xì)胞色素還原酶、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；

雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)，因而酶必然有四級空間結(jié)構(gòu)形式，

一級結(jié)構(gòu)是指具有一定氨基酸順序的多肽鏈的共價骨架，

二級結(jié)構(gòu)為在一級結(jié)構(gòu)中相近的氨基酸殘基間由氫鍵的相互作用而形成的帶有螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲等細(xì)微結(jié)構(gòu)，

三級結(jié)構(gòu)系在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行分子盤曲以形成包括主側(cè)鏈的專一性三維排列，

四級結(jié)構(gòu)是指低聚蛋白中各折疊多肽鏈在空間的專一性三維排列。具有低聚蛋白結(jié)構(gòu)的酶(寡聚酶)必須具有正確的四級結(jié)構(gòu)才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被廣泛折疊、結(jié)構(gòu)緊密的多肽鏈，其氨基酸親水基團(tuán)在外表，而疏水基團(tuán)向內(nèi)。（二）酶的組成酶單純酶結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶

與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔基

與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑

金屬離子作為輔助因子。酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。酶蛋白有3種組成形式:單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物（三）單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物1.單體酶（monomericenzyme)：僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應(yīng)。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由幾個或多個亞基組成，亞基牢固地聯(lián)在一起，單個亞基沒有催化活性。亞基之間以非共價鍵結(jié)合。3.多酶復(fù)合物(multienzymesystem)：幾個酶鑲嵌而成的復(fù)合物。這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng)。丙酮酸脫氫酶系（E.coli）：丙酮酸脫氫酶（EⅠ）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（EⅡ）和二氫硫辛酰脫氫酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ堿性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲（1）活性部位在酶分子的總體中只占相當(dāng)小的部分，通常只占整個酶分子體積的1%～2%。（2）酶的活性部分是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體。（3）酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補(bǔ)的，而是在酶和底物結(jié)合的過程中，底物分子或酶分子，有時是兩者的構(gòu)象同時發(fā)生了一定的變化后才互補(bǔ)的，這時催化基團(tuán)的位置也正好在所催化底物鍵的斷裂和即將生成鍵的適當(dāng)位置。（4）酶的活性部位通常在酶的表面空隙或裂縫處，形成促進(jìn)底物結(jié)合的優(yōu)越的非極性環(huán)境。（5）底物通過次級鍵較弱的力結(jié)合到鍵上。（6）酶活性部位具有柔性或可運(yùn)動性。結(jié)合部位Bindingsite酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。酶分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對酶起激活或抑制作用。調(diào)控部位Regulatorysite必需基團(tuán)：酶的分子中與酶活性有關(guān)的基團(tuán)稱為酶的必需基團(tuán)(essentialgroup)?；钚圆课唬罕匦杌鶊F(tuán)雖然在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，集中在一起形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，該區(qū)域與底物相結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，這一區(qū)域稱為酶的活性中心(activecenter)。必需基團(tuán)活性部位必需基團(tuán)維持酶的空間結(jié)構(gòu)（中心外必需基團(tuán)）結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)專一性催化性質(zhì)2、必需基團(tuán)主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酶活性中心的必需基團(tuán)酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基半胱氨酸的巰基等。3、研究酶活性部位的方法

（1）酶的專一性研究（2）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法非特異性共價修飾特異性共價修飾親和標(biāo)記（affinitylabeling）法（3）動力學(xué)參數(shù)測定法（4）X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法（5）定點(diǎn)誘變法

酶的活性部位(activesite)是結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個酶分子相當(dāng)小的一部分，它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體?；钚圆课煌ǔＴ诿傅谋砻婵障痘蛄芽p處，形成促進(jìn)底物結(jié)合的優(yōu)越的非極性環(huán)境。在活性部位，底物被多重的、弱的作用力結(jié)合(靜電相互作用、氫鍵、范德華鍵、疏水相互作用)，在某些情況下被可逆的共價鍵結(jié)合。酶結(jié)合底物分子，形成酶-底物復(fù)合物(enzyme-substratecomplex)。酶活性部位的活性殘基與底物分子結(jié)合，首先將它轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài)，然后生成產(chǎn)物，釋放到溶液中。這時游離的酶與另一分子底物結(jié)合，開始它的又一次循環(huán)。酶如何結(jié)合？已經(jīng)提出有兩種模型解釋酶如何結(jié)合它的底物。鎖鑰模型(lock-and-keymodel)：1894年EmilFischer提出鎖鑰模型，底物的形狀和酶的活性部位被認(rèn)為彼此相適合，像鑰匙插入它的鎖中，兩種形狀被認(rèn)為是剛性的和固定的，當(dāng)正確組合在一起時，正好互相補(bǔ)充。

誘導(dǎo)契合模型(induced-fitmodel)：是1958年提出的，底物的結(jié)合在酶的活性部位誘導(dǎo)出構(gòu)象變化，此外酶可以使底物變形，迫使其構(gòu)象近似于它的過渡態(tài)。例如，葡萄糖與己糖激酶的結(jié)合，當(dāng)葡萄糖剛剛與酶結(jié)合后，即誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一種構(gòu)象變化，使活化部位與底物葡萄糖形成互補(bǔ)關(guān)系。不同的酶表現(xiàn)出兩種不同的模型特征，某些是互補(bǔ)性的，某些是構(gòu)象變化?！叭c(diǎn)結(jié)合”的催化理論認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)。研究酶的催化作用機(jī)理，一般采用兩種方法。一種方法是從非酶系統(tǒng)模式獲得催化作用規(guī)律，其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)簡單，易于探究，而其缺點(diǎn)是非酶系統(tǒng)與酶系統(tǒng)不同，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一定完全適合于闡明酶的催化作用。另一種方法是從酶的結(jié)構(gòu)與功能研究中得到催化作用機(jī)理的證據(jù)。根據(jù)兩種方法的研究結(jié)果，據(jù)現(xiàn)在所知，酶的催化作用可能來自5個方面，即廣義的酸堿催化、共價催化、鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng)、變形或張力以及活性中心為疏水區(qū)域。2、酶的催化作用機(jī)理（1）廣義的酸堿催化(acid-basecatalysis)

酸堿催化是通過瞬時的向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物接受質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)的一類催化機(jī)制。

狹義的酸堿催化劑即是H+與OH-。廣義的酸堿是指能供給質(zhì)子(H+)與接受質(zhì)子的物質(zhì)。酸堿催化劑是催化有機(jī)反應(yīng)中普遍、有效的催化劑。它們在酶反應(yīng)中的協(xié)調(diào)一致可能起到特別重要的作用。由于生物體內(nèi)酸堿度偏于中性，在酶反應(yīng)中起到催化作用的酸堿不是狹義的酸堿，而是廣義的酸堿。在所有的廣義酸堿的功能基團(tuán)中以組氨酸的瞇唑基特別重要，其理由有以下兩點(diǎn)：一是咪唑基在中性溶液條件下有一半以質(zhì)子供體(廣義酸)形式存在，另一半以質(zhì)子受體(廣義堿)形式存在。它可在酶的催化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；二是咪唑基供給質(zhì)子或接受質(zhì)子的速度十分迅速，而且兩者的速度幾乎相等，因此咪唑基是酶的催化反應(yīng)中最有效、最活潑的一個功能基團(tuán)。Figure8-9Manyorganicreactionsarepromotedbyprotondonors(generalacids)orprotonacceptors(generalbases).Theactivesitesofsomeenzymescontainaminoacidfunctionalgroups,suchasthoseshownhere,thatcanparticipateinthecatalyticprocessasprotondonorsorprotonacceptors

（2）共價催化所謂共價催化就是底物與酶以共價方式形成中間物。這種中間物可以很快轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨艽鬄榻档偷霓D(zhuǎn)變態(tài)，從而提高催化反應(yīng)速度。例如糜蛋白酶與乙酰對硝基苯酯可結(jié)合成為乙酰糜蛋白酶的復(fù)合中間物，同時生成對硝基苯酚。在復(fù)合中間物中乙?；c酶的結(jié)合為共價形式。乙酰糜蛋白酶與水作用后，迅速生成乙酸并釋放出糜蛋白酶。乙酰糜蛋白酶是共價結(jié)合的酶-底物(enzyme-substrate，ES)復(fù)合物。能形成共價ES復(fù)合物的酶還有一些。親核催化劑之所以能發(fā)揮催化作用是由于它能供給底物一對電子。這種傾向是催化反應(yīng)速度的部分或全部決定因素。由于給予電子，催化劑就可與底物共價結(jié)合，而這種共價結(jié)合的中間物可以很快地分解，結(jié)果反應(yīng)速度大大加快。共價催化的常見型式是酶的催化基團(tuán)中親核原子對底物的親電子原子的攻擊。它們類似親核試劑與親電試劑。所謂親電試劑就是一種試劑具有強(qiáng)烈親和電子的原子中心。帶正電離子如Mg2+與NH4+是親電子的，含有-C=O及-C=N-基團(tuán)的化合物也是親電子的，其中-G=O的O及-C=N-的N都有吸引電子的傾向，因而使得鄰近的C原子缺乏電子。為了表示這種狀態(tài)，可以δ+表示，而吸引電子的O與N則可以δ-表示。其電子移動的方向則以從δ+至δ-的彎曲箭頭線表示，如下式：親電催化劑正好與親核催化劑相反，之所以能發(fā)揮催化作用是由于它能從底物移去一對電子。它從底物移去電子的步驟才是反應(yīng)速度的決定因素。事實(shí)上，親電步驟與親核步驟常常相互在一起發(fā)生的。當(dāng)催化劑為親核催化劑時，它就會進(jìn)攻底物中的親電核心。反之亦然。在酶促反應(yīng)中，酶的親核基團(tuán)對底物的親電核心起作用要比酶的親電基團(tuán)對底物的親核中心起作用的可能性大得多。酶和底物復(fù)合物的形成過程既是專一性的識別過程，更重要的是分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)的過程，在這一過程中包括兩種效應(yīng)：鄰基效應(yīng)：化學(xué)反應(yīng)速度與反應(yīng)物濃度成正比，若在反應(yīng)系統(tǒng)的某一局部區(qū)域，底物濃度增高，則反應(yīng)速度也隨之提高，在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，底物的反應(yīng)基團(tuán)與酶的催化基團(tuán)越靠近，底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，其反應(yīng)速度越快。定向效應(yīng)：由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。因?yàn)槎ㄏ蛐?yīng)，分子內(nèi)反應(yīng)比分子間反應(yīng)快；分子間反應(yīng)時，基團(tuán)相距較近比較遠(yuǎn)快。

（3）鄰基效應(yīng)和定向效應(yīng)例（分子間現(xiàn)分子內(nèi)反應(yīng)的比較）

咪唑和對-硝基苯酚乙酸酯的反應(yīng)是一個雙分子氨解反應(yīng)（分子間氨解反應(yīng)）對硝基苯酚乙酸酯咪唑N-乙酰咪唑?qū)ο趸椒永龑?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子內(nèi)咪唑基參與的氨解反應(yīng)速度比相應(yīng)的分子間反應(yīng)速度大24倍。說明咪唑基與酯基的相對位置對水解反應(yīng)速度具有很大的影響。（分子內(nèi)氨解反應(yīng)）以雙羧酸的單苯基酯的分子內(nèi)催化為例，當(dāng)一C00—與酯鍵相靠較遠(yuǎn)時，酯水解相對速度為1，而兩者相隔很近時，酯水解速度可增加53倍。有人認(rèn)為，這種加速效應(yīng)可能使反應(yīng)增加108倍。要使酶既與底物靠近，又與底物定向，就要求底物必須為酶的最適宜底物。當(dāng)特異底物與酶結(jié)合時，酶蛋白發(fā)生一定構(gòu)象變化，與底物發(fā)生誘導(dǎo)契合。嚴(yán)格來講，僅僅靠近還不能解釋反應(yīng)速度的提高。要使鄰近效應(yīng)達(dá)到提高反應(yīng)速度的效果，必須是既靠近又定向，即酶與底物的結(jié)合達(dá)到最有利于形成轉(zhuǎn)變態(tài)，使反應(yīng)加速(圖1-3)。（4）變形或張力當(dāng)酶遇到其專一性底物時，酶中某些基團(tuán)或離子可以使底物分子內(nèi)敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力”，使敏感鍵的一端更加敏感，底物分子發(fā)生形變，底物比較接近它的過渡態(tài)，降低了反應(yīng)活化能，使反應(yīng)易于發(fā)生?；衔颕的水解反應(yīng)速度快，而化合物Ⅱ水解反應(yīng)速度小，這是因?yàn)榍罢叩姆磻?yīng)物中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在張力，而后者的反應(yīng)物卻無環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩者反應(yīng)速度常數(shù)的比值為，這表明，張力或變形可使反應(yīng)速度常數(shù)增加108倍。（5）酶的活性中心為疏水區(qū)域酶的活性中心常為酶分子的凹穴。此處常為非極性或疏水性的氨基酸殘基。疏水區(qū)域的特點(diǎn)是介電常數(shù)低，并排出極性高的水分子。這使得底物分子的反應(yīng)鍵和酶的催化基團(tuán)之間易發(fā)生反應(yīng)，有助于加速酶催化反應(yīng)。第六節(jié)、酶活力的測定1、酶活力與酶反應(yīng)速度1.1

酶活力（enzymeactivity）：也稱酶活性，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可用在一定條件下，它所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)初速度（reactionrate）來表示。1.2.

酶反應(yīng)速度：用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或增加量來表示。單位：濃度/單位時間要求：快速、簡便、準(zhǔn)確兩個階段：酶在一定條件下與底物反應(yīng)一段時間然后再測定反應(yīng)物中底物或產(chǎn)物的濃度變化量。步驟：（1）配制底物溶液。（2）確定反應(yīng)條件。（3）反應(yīng)開始，記時間（4）反應(yīng)完畢注意終止反應(yīng)。（5）測定產(chǎn)物的生產(chǎn)量或底物的減少量。2、酶活力測定方法3、酶的活力單位(1).酶的活力單位（U-activityunit）：1961年，提出用“國際單位”（IU）表示酶活力，即：1個酶活力單位，是指在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)的酶量。(25C,最適底物濃度和最適pH）1IU=1mol/min1972年，提出新的酶活力國際單位：最適條件下，每秒鐘能催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為1Kat=1mol/s所以：1Kat=60X106IU

習(xí)慣用法：每小時催化1克底物所需的酶量。(2).酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)即酶比活力＝酶活力／mg酶蛋白。IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。實(shí)質(zhì)表示單位蛋白質(zhì)的催化能力。4、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)與催