植物激素免疫測(cè)定指南

本文格式為Word版，下載可任意編輯——植物激素免疫測(cè)定指南植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）

免疫測(cè)定是利用抗原、抗體特異性反應(yīng)而建立的，根據(jù)可視化方法的不同可分為：酶聯(lián)免疫、放射免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、生物發(fā)光免疫測(cè)定、濁度免疫測(cè)定法等。由于酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linkedImmunosorbentAssays,簡(jiǎn)稱ELISA）具有靈敏性、特異性高，且便利、快速、安全、成本低廉的特點(diǎn)，而日益被廣泛應(yīng)用于植物激素測(cè)定。目前，幾大類植物激素IAA,ABA,GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相應(yīng)的ELISA方法并有試劑盒出售。

植物激素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法有兩種形式（見(jiàn)下圖），一種是在固相載體上直接包被抗體（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一種是包被抗原（間接法）。

直接法利用游離抗原和酶標(biāo)抗原與吸附的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。間接法利用游離抗原和吸附抗原與游離抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。間接法的原理可用下式表示：

Ab+H+HP=AbH+AbHP

其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白質(zhì)復(fù)合物。根據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)該反應(yīng)體系中Ab及HP的量確定時(shí)，游離H越多，結(jié)合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即結(jié)合在板上的抗體就越少，通過(guò)酶標(biāo)二抗檢測(cè)結(jié)合物AbHP的多少，就可以確定游離H量的多少。

材料、試劑及設(shè)備

1材料

各種新鮮植物材料2儀器設(shè)備

研缽，冷凍離心機(jī)，臺(tái)式快速離心濃縮枯燥器或氮?dú)獯蹈裳b置，酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)，吸水紙，恒溫箱，冰箱，酶標(biāo)板（40孔或96孔），可調(diào)微量液體加樣器（10μl，40μl,200μl,1000μl），帶蓋瓷盤(pán)（內(nèi)鋪濕紗布）。3試劑

(1)包被緩沖液：稱取１.５gNa2CO3,2.93gNaHCO3,0.2gNaN3（可不加）,用量筒加1000ml蒸餾水，pH為9.6.

(2)磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4·12H2O，用量筒加1000ml蒸餾水，pH為7.5。

(3)樣品稀釋液：100mlPBS中加0.1mlTween-20，0.1g明膠（稍加熱溶解）。

(4)底物緩沖液：稱取5.10gC6H8O7·H2O（檸檬酸），18.43gNa2HPO4·12H2O，溶解定容至1000ml，再加1mlTween-20，pH為5.0。

(5)洗滌液：1000mlPBS加1mlTween-20。(6)終止液：2mol/LH2SO4。

（7）提取液：80％甲醇，內(nèi)含1mmol/LBHT(二叔丁基對(duì)甲苯酚，為抗氧化劑，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的濃度))。

（8）激素包被抗原、各激素抗體和標(biāo)準(zhǔn)物。

（9）酶標(biāo)二抗：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體。

操作步驟

1．樣品中激素的提取

（1）稱取0.5-1.0g新鮮植物材料（若取樣后材料不能馬上測(cè)定，用液氮速凍后保存在-20℃的低溫冰箱中），加2ml樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10ml試管，再用2ml提取液分次將研缽沖洗清白，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4℃冰箱中。

（2）4℃下提取4h，1000g離心15min(試驗(yàn)中離心機(jī)型號(hào)LDZ5-2，約4000rpm),取上清液。沉淀中加1ml提取液，攪勻，置4℃下再提取1h，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。?）上清液過(guò)C-18固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開(kāi)樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。

（4）將過(guò)柱后的樣品轉(zhuǎn)入5ml塑料離心管中，真空濃縮枯燥或用氮?dú)獯蹈桑ヌ崛∫褐械募状?，用樣品稀釋液定容（一?g鮮重用1.5ml左右樣品稀釋液定容）。2．樣品測(cè)定

（1）包被：在10ml包被緩沖液中參與一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見(jiàn)試劑盒標(biāo)簽），混勻，在酶標(biāo)板每小孔中加100μl。然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤(pán)內(nèi)，置于37℃下3h。（2）洗板：將包被好的板取出，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液，將下口瓶?jī)?nèi)的洗滌液通過(guò)乳膠管均勻參與板上，使每孔充滿洗滌液，放置約0.5min,再甩掉洗滌液。重復(fù)3次，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。

（3）競(jìng)爭(zhēng)：即加標(biāo)準(zhǔn)物、待測(cè)樣和抗體。

加標(biāo)樣及待測(cè)樣：取樣品稀釋液0.98ml，內(nèi)加20μl激素的標(biāo)樣試劑（100μg／ml）,即為2000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)液，然后再依次稀釋1000ng/ml,500ng/ml,250/ng/ml,125ng/ml…,0ng/ml。將系列標(biāo)準(zhǔn)樣參與96孔酶標(biāo)板的前三行，每個(gè)濃度加3孔，每孔50μl,其余孔加待測(cè)樣，每個(gè)樣品重復(fù)三孔，每孔50μl。

加抗體：在5ml樣品稀釋液中參與一定量的抗體（最適稀釋倍數(shù)見(jiàn)試劑盒標(biāo)簽）,混勻后每孔加50μl，然后將酶標(biāo)板參與濕盒內(nèi)開(kāi)始競(jìng)爭(zhēng)。

競(jìng)爭(zhēng)條件37℃左右0.5h。（GA4為37℃、17分鐘）

（4）洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意以下兩點(diǎn)：①加洗滌液時(shí)一定要從標(biāo)準(zhǔn)曲線的低濃度一邊向高濃度一邊加，并且酶標(biāo)板要向高濃度的一邊傾斜。②第一次參與洗滌液后要馬上甩掉。然后再接著加其次次。注意這兩點(diǎn)的目的是防止各孔的交織反應(yīng)。

（5）加二抗：將一定量的酶標(biāo)羊抗兔抗體，參與10ml樣品稀釋液中（最適稀釋倍數(shù)見(jiàn)試劑盒標(biāo)簽），混勻后，在酶標(biāo)板每孔加100μl，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37℃下，溫育0.5h。（6）洗板：方法同競(jìng)爭(zhēng)之后的洗板（步驟4），洗五次，

（7）加底物顯色：稱取10-20mg鄰苯二胺（OPD）溶于10ml底物緩沖液中（防備勿用手接觸OPD），完全溶解后加2~4μl30%H202?；靹?，在每孔中加100μl（在暗處操作），然后放入濕盒內(nèi)，當(dāng)顯色適當(dāng)后（即0ng/ml孔與2000ng/ml孔的OD差值為1.0左右時(shí)），每孔參與50μl2mol/L硫酸終止反應(yīng)。

（8）比色：用2000ng/ml濃度孔（即標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度孔）調(diào)0，在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品490nm處的OD值。

結(jié)果計(jì)算與分析

用于ELISA結(jié)果計(jì)算最便利的是logit曲線。曲線的橫坐標(biāo)用激素標(biāo)樣各濃度（ng/ml）的自然對(duì)數(shù)表示，縱坐標(biāo)用各濃度顯色值的logit值表示。Logit值的計(jì)算方法如下：B/B0B

Logit（B/B0）=ln————=ln————1-B/B0B0-B

其中B0是0ng/ml孔的顯色值，B是其它濃度的顯色值。

作出的logit曲線在檢測(cè)范圍內(nèi)應(yīng)是直線。待測(cè)樣品可根據(jù)其顯色值的logit值從圖上查出其所含激素濃度（ng/ml）的自然對(duì)數(shù)，再經(jīng)過(guò)反對(duì)數(shù)即可知其激素的濃度（ng/ml）。

另外，也可用激素標(biāo)樣各濃度（ng/ml）的自然對(duì)數(shù)與各濃度顯色值的logit值的回歸方程代替logit曲線，求得樣品激素的濃度。一般來(lái)說(shuō)，二種方法求得的結(jié)果會(huì)略有差異。求得樣品中激素的濃度后，樣品中激素的含量（ng/g·fw）可用下式計(jì)算：N·V2·V3·BA=—————V1·W

其中，A表示激素的含量（ng/g·fw）；V2表示提取樣品后，上清液的總體積；

V1表示進(jìn)行真空濃縮枯燥的上清液體積；（當(dāng)提取的上清液全部進(jìn)行真空濃縮枯燥時(shí)V1與V2的體積是相等的）

V3表示真空濃縮后用樣品稀釋液定容的體積；W表示樣品的鮮重；

N表示樣品中激素的濃度（ng/ml）；

B表示樣品的稀釋倍數(shù)（樣品稀釋液定容以后的稀釋倍數(shù)）。

本卷須知

激素提取液中是否存在干擾物質(zhì)的判斷和去除

尋常用以下幾個(gè)質(zhì)量控制試驗(yàn)來(lái)判斷提取液中是否存在干擾物質(zhì)：①稀釋試驗(yàn)，即將樣品提取液做一系列稀釋，進(jìn)行ELISA測(cè)定，所獲得的劑量反應(yīng)曲線應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線平行，或者說(shuō)測(cè)定值與稀釋倍數(shù)相對(duì)應(yīng)，例如做10倍稀釋，則測(cè)定值應(yīng)是原值的1／10，若差異太大，說(shuō)明有干擾物存在。②平行試驗(yàn)，即將樣品提取液定量參與系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)物之中，進(jìn)行ELISA測(cè)定，所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)與不加樣品液的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行，否則可以斷定有干擾物存在。③回收率試驗(yàn)，將樣品分為完全等量的兩份，一份參與已知量的標(biāo)準(zhǔn)激素，另一份做對(duì)照，進(jìn)行提取測(cè)定，兩個(gè)測(cè)定值之差與參與值之比即為回收率，若回收率過(guò)低或者超過(guò)100％，也說(shuō)明有干擾物存在。④儀器法校正試驗(yàn)，ELISA測(cè)定的樣品量極微，而且樣品純度要求比儀器法要低得多，因而用尋常的氣譜或液譜法難以對(duì)ELISA作出校正，目前用高分辯率的氣質(zhì)聯(lián)機(jī)可以對(duì)ELISA作出校正，目前用高分辯率的氣質(zhì)聯(lián)機(jī)可以對(duì)ELISA測(cè)定作出適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)。

樣品中存在的干擾物質(zhì)有色素、酚類物質(zhì)等。酚類物質(zhì)可用可溶性與不可溶性PVP（聚乙烯吡咯烷酮）除去，可溶性PVP可直接溶于樣品提取液中，不溶性PVP可在研磨時(shí)參與。一般材料在參與0-100mgPVP/gFW即可達(dá)理想效果。葉綠素等色素可通過(guò)將激素提取液過(guò)C18預(yù)處理小柱去除。

2為得到較好效果，操作一定要認(rèn)真，注意：（1）在整個(gè)ELISA操作過(guò)程中，每次加樣盡可能

一致，速度要快。（2）若同時(shí)做二塊以上的板，應(yīng)將洗好的板放在4℃下，依次拿出加樣。（3）加樣的環(huán)境溫度不宜過(guò)高。（4）不使用邊緣孔時(shí)，每次加樣后，也應(yīng)在邊緣孔內(nèi)參與相應(yīng)的溶液。（5）在正式樣品測(cè)定之前，先通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)找到包被抗原、抗體、二抗的最適稀釋倍數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)物的