梅毒實驗室檢測

梅毒實驗室檢測第1頁/共62頁梅毒的實驗室診斷第2頁/共62頁病原體為梅毒螺旋體，屬于密螺旋體屬，蒼白密螺旋體蒼白亞種(Treponemapallidumsubspeciespallidum)

蒼白亞種梅毒蒼白螺旋體地方亞種地方性梅毒極細(xì)亞種雅司病密螺旋體屬

品他螺旋體品他病第3頁/共62頁梅毒螺旋體的生物學(xué)特性1、直徑0.10~0.15μm，有8~14個致密而規(guī)則的小螺旋，兩端尖直。2、原生質(zhì)圓柱體上緊繞著3~4根周漿鞭毛，故運動活躍，運動方式多樣。3、G-，但不易著色。Fantana鍍銀染色呈棕褐色。4、在無活細(xì)胞的人工培養(yǎng)基中難培養(yǎng)，生長慢。5、抵抗力極弱，對溫度和干燥特別敏感；對青霉素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感。在干燥條件下不易生存。肥皂水和一般消毒劑以及加溫42℃以上均極易將其殺滅。第4頁/共62頁梅毒螺旋體第5頁/共62頁傳播途徑

性接觸是主要的傳染途徑未經(jīng)治療的患者在感染后的1年內(nèi)最具有傳染性隨著病期的延長，傳染性越來越小到感染后2年，通過性接觸一般無傳染性母嬰傳播在妊娠7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染未經(jīng)治療者，雖已無性傳播（病期>2年），但妊娠時仍可傳染給胎兒病期越長，傳染性越小;輸血傳染間接傳播：日常用品、接吻、哺乳、醫(yī)療器械等途徑（接觸部位附有梅毒螺旋體）。第6頁/共62頁梅毒的分期第7頁/共62頁梅毒的診斷梅毒的診斷早期梅毒（一期、二期和早期隱性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隱性梅毒）必須依靠病史、癥狀及實驗檢查進(jìn)行綜合分析梅毒的實驗室檢查結(jié)果對診斷有決定性意義第8頁/共62頁常用梅毒實驗室檢測方法病原學(xué)檢測血清學(xué)檢測第9頁/共62頁病原學(xué)檢查取材方法一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液暗視野顯微鏡、鍍銀染色法和直接熒光法在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進(jìn)行檢測。白色發(fā)光，螺旋整齊，運動規(guī)律（旋轉(zhuǎn)、伸縮或蛇行運動）第10頁/共62頁病原學(xué)檢查的臨床意義病原學(xué)方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，且具有快速、方便、易操作的特點。螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。第11頁/共62頁梅毒血清學(xué)檢測方法第12頁/共62頁梅毒血清學(xué)檢測分類非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗（非特異性梅毒抗體）梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗（特異性梅毒抗體）第13頁/共62頁非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗原理（抗心磷脂抗體）：人體感染了梅毒螺旋體后，組織受到破壞，釋放出來的一種類脂成分，與梅毒螺旋體結(jié)合形成完全抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗體（反應(yīng)素）。主要是IgM和IgG混合抗體?？贵w產(chǎn)生時間感染3周-4周，硬下疳出現(xiàn)1周-2周一般在感染后5～7周（或硬下疳出現(xiàn)后2～3周）產(chǎn)生?？贵w作用無保護(hù)作用，治療監(jiān)測。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的反應(yīng)素可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應(yīng)素可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性。第14頁/共62頁原理和方法反應(yīng)原理抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見抗原基本成分心磷脂、卵磷脂和膽固醇方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR)不加熱血清反應(yīng)素(USR)甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）性病研究實驗室試驗(VDRL)等。第15頁/共62頁四種非特異性試驗方法比較VDRLUSRRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、膽固醇同前+EDTA+氯化膽堿同前+EDTA+氯化膽堿+活性炭同前+EDTA+氯化膽堿+甲苯胺紅抗原穩(wěn)定性不穩(wěn)定,1天穩(wěn)定4℃～8℃保存12個月穩(wěn)定4℃～8℃保存12個月穩(wěn)定4℃～8℃保存12個月血清試驗前處理需滅活不需滅活不需滅活不需滅活反應(yīng)板及結(jié)果判斷玻片，肉眼或顯微鏡玻片，肉眼或顯微鏡紙卡片，肉眼紙卡片，肉眼注釋唯一用于檢查腦脊液的試驗，診斷神經(jīng)梅毒結(jié)果容易判斷結(jié)果容易判斷一期敏感性（未經(jīng)治療）74%-87%77%-88%77%-99%77%-99%二期敏感性（未經(jīng)治療）100%100%100%100%晚期敏感性（未經(jīng)治療）98%99%98%99%第16頁/共62頁RPR/TRUST檢測流程試驗前期準(zhǔn)備RPR儀(水平旋轉(zhuǎn)儀器)必須滴??！試劑

50μl移液器、吸頭記號筆、廢物缸工作服一次性手套、口罩、帽子生物安全柜第17頁/共62頁梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀第18頁/共62頁測速:100轉(zhuǎn)/MIN（±2轉(zhuǎn)）第19頁/共62頁檢測流程（定性）加樣：吸取50μl血清（漿）放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)。加抗原：將抗原輕輕搖勻，用試劑盒提供的針頭加1滴抗原。反應(yīng)：將卡片置梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀8分鐘立即在亮光下觀察結(jié)果。第20頁/共62頁檢測流程（定量）稀釋液準(zhǔn)備：在圈內(nèi)加入50μl生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。加樣：吸取50μl血清(漿)與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布滿整個圈內(nèi)。重復(fù)定性試驗后兩步。第21頁/共62頁凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級：3+～4+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的紅色絮狀物，液體清亮。2+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到大的紅色絮狀物，液體較清亮。1+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的紅色絮狀物，液體渾濁?！簣A圈內(nèi)僅見紅色集中于中央一點或均勻分散。第22頁/共62頁RPR定量試驗中等至大的凝塊為陽性（圈4和7）有明確但很小的凝塊為弱陽性（圈2和3）顆粒均勻分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）為陰性第23頁/共62頁第24頁/共62頁臨床意義早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個月，VDRL試驗抗體滴度下降2個稀釋度，6個月下降4個稀釋度。一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性早期梅毒硬下疳出現(xiàn)1周-2周后，血清可呈陽性。經(jīng)治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。第25頁/共62頁假陽性問題假陽性：非梅毒患者的血清反應(yīng)呈陽性①技術(shù)性假陽性由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細(xì)胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成。②生物學(xué)假陽性是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性第26頁/共62頁急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾病風(fēng)疹水痘傳染性單核細(xì)胞增多癥傳染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹第27頁/共62頁慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡自身免疫性溶血性貧血盤狀紅斑狼瘡結(jié)節(jié)性多動脈炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎橋本氏甲狀腺炎風(fēng)濕性心臟病干燥綜合征毒品癮者慢性腎炎肝硬化老年麻風(fēng)(是唯一產(chǎn)生慢性生物學(xué)假陽性的感染性疾病)第28頁/共62頁妊娠的假陽性反應(yīng)這是一種生理情況下的生物學(xué)假陽性

假陽性發(fā)生率較低有報告為0.4%，滴度低。第29頁/共62頁假陽性問題梅毒假陽性反應(yīng)的處理技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗即可除外。對急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)，應(yīng)做TPHA（TPPA）等試驗進(jìn)行排除。第30頁/共62頁前帶現(xiàn)象原理指二期梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗中，有時血清中存在高濃度的抗體時出現(xiàn)的弱陽性、不典型或陰性反應(yīng)的結(jié)果。處理將血清稀釋后再進(jìn)行試驗。第31頁/共62頁血清固定耐血清性（血清固定）指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗在一定時期內(nèi)不陰轉(zhuǎn)。早期的耐血清性常與治療量不足或不規(guī)則治療、復(fù)發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關(guān)。第32頁/共62頁梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗第33頁/共62頁試驗原理檢測血中特異性抗梅毒螺旋體特異蛋白為抗原的抗體（IgG和IgM）。特異性IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染2周后即可測出。第34頁/共62頁實驗方法梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)

梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)

梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA）梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(RT)

熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）第35頁/共62頁TPPA/TPHA原理TPPA試驗原理與TPHA試驗基本相同TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒TPHA試驗中梅毒螺旋體致敏羊紅細(xì)胞特點梅毒螺旋體(Nichols株)全抗原第36頁/共62頁操作步驟1.試劑準(zhǔn)備：試驗前將試劑和待檢標(biāo)本恢復(fù)到室溫。

2.加稀釋液：每份樣本做4孔，加標(biāo)本稀釋液加至微量反應(yīng)板孔內(nèi)，第1孔100微升，第2～4孔各25微升。3.樣本稀釋：取血清25微升加至第1孔，混勻后取25微升至第2孔，混勻后取25微升至第3孔，混勻后取25微升至第4孔，混勻后棄去25微升。4.加對照液：第3孔加未致敏顆粒25微升，第4孔加致敏顆粒25微升。5.混合：將反應(yīng)板置振蕩器振蕩30秒。6.反應(yīng)：置有蓋濕盒，孵育2h，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。

第37頁/共62頁結(jié)果判斷1.觀察加未致敏顆粒的第3孔，不出現(xiàn)凝集為有效試驗。

2.觀察凝集反應(yīng)強(qiáng)度：分級如下。

4+：顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊。

3+：顆粒光滑覆蓋大部分孔底。

2+：顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán)。

1+：

顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán)。

±：顆粒沉集孔底，中央形成一小點。

一：顆粒緊密沉積孔底中央。第38頁/共62頁第39頁/共62頁熒光螺旋體抗體吸收試驗

（FTA-ABS）原理將有完整形態(tài)的梅毒螺旋體作為抗原，加上經(jīng)吸收劑（用Reiter螺旋體制備而成）吸收過的梅毒患者血清形成抗原抗體復(fù)合物，再加入異硫氰酸熒光素（FTIC）標(biāo)記的抗人免疫球蛋白，與抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，形成熒光的抗原抗體復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯出蘋果綠色的熒光，即為陽性反應(yīng)。曾經(jīng)認(rèn)為FTA-ABS試驗是檢測梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗。第40頁/共62頁TP-ELISA原理用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標(biāo)記物，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應(yīng)。特點本法可用于大規(guī)模血清檢測。第41頁/共62頁免疫層析第42頁/共62頁臨床應(yīng)用梅毒螺旋體試驗的作用是作為證實試驗它們可以幫助確定非梅毒螺旋體試驗陽性反應(yīng)是真陽性還是假陽性。一旦這些試驗呈陽性，則患者終身陽性。第43頁/共62頁方法特點特異性強(qiáng)，敏感性高很少出現(xiàn)假陽性。據(jù)統(tǒng)計，在普通人群中，有1%的生物學(xué)假陽性發(fā)生。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可使FTA-ABS試驗呈假陽性反應(yīng)，但大多數(shù)病例中螺旋體呈串株狀熒光。傳染性單核細(xì)胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPHA呈假陽性。麻風(fēng)患者也可使特異試驗呈陽性。第44頁/共62頁臨床意義作為RPR初篩陽性標(biāo)本的確證試驗。不能作為療效觀察的指標(biāo)。陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合RPR結(jié)果進(jìn)行診斷。第45頁/共62頁假陽性問題存在交叉反應(yīng)的抗體處理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反應(yīng)的抗體。第46頁/共62頁老年人抗體陽性的問題1、真陽性2、假陽性：這些老年患者所患的基礎(chǔ)疾病可能使機(jī)體釋放誘導(dǎo)產(chǎn)生抗類脂抗體和/或抗T.pallidum抗體的交叉抗原；第47頁/共62頁梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果解釋第48頁/共62頁梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果的臨床意義RPRTRUSTTPPATP-ELISA臨床意義陰性陰性排除梅毒（一期梅毒的早早期）陽性陽性現(xiàn)癥梅毒(梅毒孕婦所生的嬰兒除外)陽性陰性生物學(xué)假陽性陰性陽性早期梅毒經(jīng)治療后（早期梅毒）第49頁/共62頁RPR結(jié)果解釋示意圖治療前治療后早期一期二期早期潛伏晚期晚期潛伏三期

陽性陰性第50頁/共62頁TPPA結(jié)果解釋示意圖治療前治療后早期一期二期早期潛伏晚期晚期潛伏三期

陽性陰性第51頁/共62頁梅毒血清學(xué)試驗適用范圍第52頁/共62頁檢測方法 樣品種類

血清血漿 末梢血 腦脊液非梅毒螺旋體試驗 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR)

甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST） 性病研究實驗室試驗(VDRL) 梅毒螺旋體試驗 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)

梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)

梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(TP-RT)

熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS） 化學(xué)發(fā)光免疫測定試驗（CLIA）