第二章微生物的保護(hù)和保藏

第二章微生物的保護(hù)和保藏第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一一、微生物資源保護(hù)微生物資源與人類生態(tài)系統(tǒng)微生物資源保護(hù)的重要性微生物資源保護(hù)策略第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已建成西南微生物種質(zhì)資源庫、基因與蛋白、微生物發(fā)酵和次生代謝產(chǎn)物研究平臺?，F(xiàn)擁有2棟獨(dú)立科研大樓，總面積達(dá)5800平方米以上。設(shè)備總值達(dá)3000多萬元。實(shí)驗(yàn)室的主要研究方向及研究領(lǐng)域?yàn)椋海?）特色生物的物種與遺傳多樣性：特色生物的基因多樣性，物種演化和區(qū)系演變的規(guī)律及其與地理環(huán)境變化的關(guān)系；動物、植物與微生物協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系與規(guī)律；特色生物資源保護(hù)的策略。（2）資源微生物利用的基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)：具重要應(yīng)用前景的微生物資源評估和生物學(xué)基礎(chǔ)研究；微生物基因工程菌構(gòu)建及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；植物寄生線蟲微生物農(nóng)藥研究；具活性的微生物次生代謝產(chǎn)物及先導(dǎo)化合物研究。（3）生物多樣性的生態(tài)功能與修復(fù)：污染及極端環(huán)境中植物、微生物的抗性、適應(yīng)及多樣性變化機(jī)制；山區(qū)土地植被變化與生物多樣性維持；關(guān)鍵區(qū)域受損生態(tài)系統(tǒng)的退化機(jī)制與恢復(fù)。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一微生物資源與人類生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)系統(tǒng)在一定時(shí)間和空間內(nèi)，生物與其生存環(huán)境以及生物與生物之間相互作用，彼此通過物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息交換，形成的一個(gè)不可分割的自然整體。第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一微生物與人類生態(tài)系統(tǒng)的相互影響

微生物對人類生態(tài)系統(tǒng)的影響

自然生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者自然界中元素的平衡者土壤肥力的保持者人類生態(tài)系統(tǒng)對微生物的影響

環(huán)境影響自然界微生物的生存

第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一微生物資源保護(hù)的重要性

維持生態(tài)系統(tǒng)平衡推動生物技術(shù)發(fā)展---生物酶等基因資源庫大量微生物資源尚需發(fā)掘第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一微生物資源保護(hù)策略天然微生物資源的保護(hù)

保護(hù)微生物的棲息生存環(huán)境生產(chǎn)菌種和專利菌種的保護(hù)

知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)

加強(qiáng)微生物資源保護(hù)法律法規(guī)建設(shè)和宣傳工作

把微生物資源作為國家的戰(zhàn)略資源來認(rèn)識，開發(fā)與保護(hù)并重第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一

目的：確保微生物生產(chǎn)性能穩(wěn)定、不染菌、不死亡等。原理：“休眠”

二、微生物物種資源的保藏第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一（一）菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點(diǎn)，人工制造環(huán)境條件，使微生物代謝處于不活潑，生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧三個(gè)條件，使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。挑選典型菌種的優(yōu)良純種一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等）創(chuàng)造適于微生物長時(shí)期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸堿中和劑等）第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一幾個(gè)概念1.衰退（degeneration）：在微生物的生長過程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負(fù)變，即菌種的衰退。第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一2.復(fù)壯(rejuvenation)狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一菌種的復(fù)壯措施純種分離純菌落的分離方法（平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法）-菌落純純細(xì)胞的分離方法（利用培養(yǎng)皿或凹玻片等作分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離；顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離；不長孢子的絲狀真菌，則可用無菌小刀切取菌落邊緣疏稀的菌絲尖端進(jìn)行分離移植，也可用無菌毛細(xì)管插入菌絲尖端，菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離）-菌株純第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一通過宿主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種至相應(yīng)的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的致病性。例如，經(jīng)過長期人工培養(yǎng)的Bacillusthuringiensis，會發(fā)生毒力減退和殺蟲效率降低等現(xiàn)象。這時(shí)，可將已衰退的菌株去感染菜青蟲等的幼蟲（相當(dāng)于一種活的選擇性培養(yǎng)基），然后可從病死的蟲體內(nèi)重新分離出典型的產(chǎn)毒菌株。如此反復(fù)進(jìn)行多次，就可提高菌株的殺蟲效率。淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）有人曾對Streptomycesmicroflavus“5406”抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，使其死亡率達(dá)到80％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗低溫的存活個(gè)體中，留下了未退化的健壯個(gè)體，從而達(dá)到了復(fù)壯的目的。第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一

防止菌種衰退的方法1控制傳代的次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)）：意即盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：在赤霉素生產(chǎn)菌Gebberellafujikuroi的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5′-核苷酸或甘露醇等豐富營養(yǎng)物時(shí)，有防止菌種衰退的效果；在Aspergillusterricola（棲土曲霉）3．942的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施，即從28～30℃提高到33～34℃來防止它產(chǎn)孢子能力的衰退。第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一3利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代：對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種。在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含幾個(gè)核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用于接種時(shí)，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實(shí)踐上創(chuàng)造了用滅過菌的棉團(tuán)輕巧地對Streptomycesmi-croflavus“5406”抗生菌進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止菌種衰退的效果；又有人發(fā)現(xiàn)，Aspergillusnidulans（構(gòu)巢曲霉）如以其分子孢子傳代就易退化，而改用子囊孢子移種則不易退化。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一4采用有效的菌種保藏方法：在用于工業(yè)生產(chǎn)的菌種中，重要的性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最易退化的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如，鏈霉素生產(chǎn)菌——Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）ЛC-1以冷凍干燥孢子形式經(jīng)過5年的保藏，在菌群中衰退菌落的數(shù)目有所增加，而在同樣情況下，另一菌株773#只經(jīng)過23個(gè)月就降低23％的活性。即使在－20℃下進(jìn)行冷凍保藏，經(jīng)12～15個(gè)月后，上述773#菌株和另一種環(huán)絲氨酸生產(chǎn)菌908#菌株的效價(jià)水平還是有明顯降低。由此說明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種生產(chǎn)性狀的衰退。第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一（二）微生物菌種保藏技術(shù)1.冷凍干燥或真空干燥保藏；2.超低溫或在液氮中冷凍保藏；3.

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?.土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一1.

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。缺點(diǎn)之一：是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一冷凍保藏種類

(1)普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)(2)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60℃～-80℃)(3)液氮冷凍保藏技術(shù)

(-196℃)第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍試管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

某些細(xì)菌和真菌菌種可通過此法保藏5年而活力不受影響。方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年

第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一液氮冷凍保藏技術(shù)

方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑適用：各大類保藏期：>15年

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一2.

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑適用：各大類保藏期：5~15年或更長第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一培養(yǎng)物的凍干過程第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一3.其他保藏方法(1)斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃

適用：各大類保藏期：1~6個(gè)月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長保藏時(shí)間(2)石蠟油封藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類保藏期：1~2年優(yōu)點(diǎn)：簡便第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一(3)砂土管保藏法方法：孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一4.

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長速度會加快。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)?；蚬こ叹鷳?yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一菌種保藏注意事項(xiàng)所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測和確定。第29頁，共31頁，2023年，2月20日，星期一加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預(yù)測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生