蔗糖酶的制備和活力測定課件

蔗糖酶的制備和比活力的測定酵母蔗糖酶的制備各級分酶溶液活性的測定（1）葡萄糖標準曲線的制備（2）蔗糖酶水解蔗糖后還原糖含量的測定3.各級分蔗糖酶溶液蛋白質含量的測定4.各級分蔗糖酶溶液比活力的計算實驗內容比色法測酶活性的原理酶活力單位（U）：在特定條件下反應1min,每產生1mmol底物所需要的酶量，或轉化底物中1mmol的有關基團的酶量。實際應用是1ml酶液所產生底物的量定為1ml酶液的活力酶的比活力:每mg酶蛋白質所具有的酶活力在蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖,最適pH值為3.5-5.5。通過測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖酶的活力，同時測定蛋白含量，從而求得酶的比活力。研磨水抽提（級分I）將研缽放入冰中，預冷去離子水稱10g酵母和約5g二氧化硅，放入研缽中緩慢加入預冷的去離子水30ml

，每次加2ml，邊加邊研磨；研磨30分鐘以上，直至酵母細胞大部分研碎將混合物轉入兩個離心管中，平衡，4度10000rpm離心15min用滴管將上清水相轉入另一個清潔離心管中，再次離心15min上清轉入量筒測體積，用1M乙酸調節(jié)pH值至5.0留出1.5ml測酶活力和蛋白質含量（冰上），余做下一步熱抽提（級分II）將級分I水浴50度30分鐘，不斷輕搖

此時可以開始做

葡萄糖標準曲線冰浴迅速冷卻3-5分鐘，4度10000rpm離心15min將上清轉入小燒杯，置于冰上留出1.5ml測酶活力和蛋白質含量（冰上），余做下一步乙醇抽提（級分III）向燒杯中的級分II加入等體積95%乙醇，攪拌，冰浴10min4度10000rpm離心15min棄去上清，倒置于抽紙上瀝干，沉淀等量分裝于兩個1.5ml的EP管中，4℃保存，做為下兩次實驗中的酶（級分III）冰浴和離心的同時，可以開始做級分I和級分II的蛋白質含量測定，酶活測定葡萄糖標準曲線的制備以零號管調零，測520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線管號試劑ml012345標準糖溶液5mM00.60.81.01.21.40.1M醋酸緩沖液2.01.41.21.00.80.60.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測定（注意保留原管酶液，以備**）以標準曲線的“0”管調零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的糖含量管號試劑ml測定管對照管級分I(3管)級分II（3管）級分I（3管）級分II（3管）10%蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸緩沖液1.31.325℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測定（注意保留原管酶液，以備**）以標準曲線的“0”管調零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的糖含量管號試劑ml測定管對照管級分I(3管)級分II（3管）級分I（3管）級分II（3管）300mM蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸緩沖液0.20.2H2O1.11.125℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min實驗結果1、葡萄糖濃度的標準曲線2、級分I和級分II中的蔗糖酶的活力（每1ml蔗糖酶溶液產生的還原糖量）3、級分I和級分II中蛋白質的含量（每1ml所含的mg）4、計算級分I和級分II蔗糖酶的比活力： 蔗糖酶的活力 1ml蛋白質的